防治马铃薯病害的(5Z)-[2-(2,4,5-三氧吡咯烷-3-亚甲基)-4-氧代-1,3-噻唑烷-5-亚甲基]乙酸甲酯类的发现

付骋宇，张 波 编译

(西安海关，陕西西安 710068)

“国际马铃薯年(2008)”的设定表明马铃薯一直而且继续为全球重要的农作物，全球数十亿人口以马铃薯为最重要的非谷类粮食作物。2014年，全球马铃薯产量约38 200万t，占所有根茎类作物产量的45%。中国是目前最大的马铃薯生产国，联合国粮农组织2014年数据显示，中国(9 600万t)、印度(4 600万t)和俄罗斯(3 200万t)的马铃薯产量几乎占全球产量的一半。种类繁多的植物病害对农业界和整个世界产生重大的经济和环境影响，其中晚疫病(Phytophthora infestans)和青枯病(Erwinia tracheiphila)被农民们认为是影响马铃薯生产的主要病害。此外，马铃薯早疫病菌(Alternaria solani)、马铃薯干腐病菌(Fusarium solani)、马铃薯炭疽病菌(Colletorichum coccodes)和丝核菌(Rhizoctonia solani)也是普遍发生的马铃薯病害。马铃薯产量差异分析说明，大部分生产者通过有效控制这些最常见的病害和使用优质、清洁种子能够实现产量翻番。化学控制可以降低病菌的感染。使用杀菌剂是化学控制成功的关键因素，但也会产生抗性。鉴于此，需要开发新型高效杀菌剂。

环外含有 C＝C的 1,3-噻唑烷-4-酮化合物被认为是潜在的杀菌剂。因此，本研究的主要目标是合成新的 2,4,5-三氧吡咯烷-3-亚甲基-4-氧代-1,3-噻唑烷-5-亚甲基化合物，并评估它们对马铃薯病害的抗菌活性。图1中化合物的结构特征为含有3个潜在生物活性基团：α-氧酰胺、富马酸酰胺和二甲酰亚胺。已有研究表明，α-酮酰胺能够通过抑制组蛋白脱乙酰基酶(HDACs)活性来调节病原真菌和植物之间相互作用。HDACs作为基因表达调控的结果，对植物真菌的致病力具有重要作用。然而，通过HDACs控制真菌致病性的特异途径知之甚少。化合物结构中的富马酸酰胺片段会影响对葡萄糖胺-6-磷酸合酶(GlcN-6-P synthase)的抑制作用。葡萄糖胺-6-磷酸合酶被认为是抗真菌药物最具前景的分子靶标之一。葡萄糖胺-6-磷酸合酶催化 D-氨基葡萄糖-6-磷酸生物合成的第一步，而D-氨基葡萄糖-6-磷酸是真菌中的几丁质、甘露糖蛋白等许多氨基糖大分子的前体。

图1 4-(4-氧代-1,3-噻唑烷-2-亚甲基)吡咯烷-2,3,5-三酮结构中的生物活性基团

二甲酰亚胺干扰由组氨酸激酶和丝裂原活化蛋白激酶级联组成的渗透信号转导途径，二甲酰亚胺杀菌剂已被应用于保护多种作物防治植物病害。

鉴于以上情况，笔者认为：对2,4,5-三氧吡咯烷-3-亚甲基-4-氧代-1,3-噻唑烷-5-亚甲基的研究很有希望研发出多作用位点的杀菌剂。多位点作用机制的杀菌剂相对于单位点作用机制的杀菌剂来说抗药性风险较低。

众多对 1,3-噻唑烷-4-酮衍生物的研究都致力于其生物活性。文献大多关注以双键与吡唑、噁唑、1,3-二硫醇、四氢吡啶、噁嗪以及融合系统连接的1,3-噻唑烷-4-酮。以前笔者介绍过1种简便的2,4,5-三氧吡咯烷-3-亚甲基-4-氧代-1,3-噻唑烷-5-亚甲基合成方法。然而，因其在溶液中不稳定，对它们的生物活性尚未研究。

本研究计划合成稳定的 2,4,5-三氧吡咯烷-3-亚甲基-4-氧代-1,3-噻唑烷-5-亚甲基衍生物，并评价其离体杀菌活性。

1 材料和方法

1.1 仪器

用装有ZnSe衰减全反射(ATR)附件的α傅立叶变换红外光谱仪(FT红外光谱，布鲁克，埃特林根，德国)测定红外光谱。以四甲基硅烷(TMS，默克，德国达姆施塔特)为内标，二甲基亚砜(DMSO)-d6和二甲基甲酰胺(DMF)-d7(剑桥同位素实验室，Tewksbury，美国MA)分别为流动相，用Avance II光谱仪(Bruker，德国卡尔斯鲁厄)测定1H和13C核磁共振(NMR)谱(分别为 400 MHz和 100 MHz)。GCMS-QP 2010“超”气相色谱质谱仪(岛津，日本京都)质谱仪，电子电离(EI)电压为70 eV测定质谱。用PE 2400 CHNS分析仪(珀金埃尔默仪器公司，美国康涅狄格州谢尔顿)进行元素分析。UV-1800分光光度计(岛津，日本京都)，在200～700 nm范围内测定吸收谱。用 SMP3熔点测定仪(Stuart，英国斯塔福德郡)测定熔点。

1.2 一般试验过程

根据文献方法合成噻唑烷 1a-1f和硫代酰胺2a-2f。化合物1a-1d和2a-2f的波谱特性与文献资料一致。

化合物 1a数据：熔点：285～287 ℃。C9H10N2O4S的分析计算值：C, 44.62; H, 4.16; N, 11.56。测量值：C, 44.63; H, 4.18; N, 11.59。

化合物 1b 数据：熔点：140～141 ℃。C15H14N2O4S的分析计算值：C, 56.59; H, 4.43; N, 8.80。测量值：C, 56.32; H, 4.42; N, 8.77。

化合物 1c 数据：熔点：195～196 ℃。C14H12N2O4S的分析计算值：C, 55.25; H, 3.97; N, 9.21。测量值：C, 55.00; H, 4.00; N, 9.18。

化合物 1d 数据：熔点：240～242 ℃。C15H14N2O5S的分析计算值：C, 53.88; H, 4.22; N, 8.38。测量值：C, 53.60; H, 4.20; N, 8.43。

化合物1e数据：黄色粉末；收率：80%；熔点：212～214 ℃；1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) (2Z,5Z)异构体(70%)：δ 3.76 (s, 3H, OMe), 6.42 (s, 1H, CH),6.56 (s, 1H, CH), 7.41～7.63(m, 3H, ArH), 7.68～8.01(m, 3H, ArH), 8.05～8.18 (m, 1H, ArH),10.97 (s, 1H,NH), 12.51 (s, 1H, NH); (2E,5Z)异构体(30%)：δ 3.78(s, 3H, OMe), 6.04 (s, 1H, CH), 6.71 (s, 1H, CH),7.41～7.63 (m, 3H, ArH), 7.68～8.01 (m, 3H, ArH),8.05～8.18 (m, 1H, ArH), 10.97 (s,1H, NH), 11.78 (s,1H, NH)；电子电离质谱分析(EI-MS, 70 eV, m/z相对强度)：57 (1), 59 (2), 68 (10), 85 (11), 89 (2), 115 (13), 116(6), 127 (2), 143 (100), 144 (12), 180 (1), 212 (7), 354(M+,7), 355 (1)。C18H14N2O4S 的分析计算值：C, 61.01;H, 3.98; N,7.90。测量值：C, 61.05; H, 3.95; N, 7.99。

化合物1f数据：黄色粉末；收率：85%；熔点：262～264 ℃；1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) (2Z,5Z)异构体(72%)：δ 3.79 (s, 3H, OMe), 6.15 (s, 1H, CH),6.56 (s, 1H, CH), 7.36～7.42(m, 1H, ArH), 7.44～7.50(m, 1H, ArH), 7.55～7.63 (m, 1H, ArH),7.78～7.89 (m,3H, ArH), 8.41 (s, 1H, ArH), 10.42 (s, 1H, NH),12.48(s, 1H, NH); (2E,5Z)异构体(28%)：δ 3.76 (s, 3H,OMe), 5.77 (s,1H, CH), 6.68 (s, 1H,－CH), 7.36～7.42(m, 1H, ArH), 7.44～7.50(m, H, ArH), 7.55～7.63 (m,1H, ArH), 7.78～7.89 (m, 3H, ArH), 8.34(s, 1H, ArH),10.40 (s, 1H, NH), 11.81 (s, 1H, NH)；电子电离质谱分析(EI-MS, 70 eV, m/z相对强度)：57 (1), 59 (2), 68(9), 85 (11), 89 (2), 115(14), 116 (6), 126 (1), 127 (2),143 (100), 144 (12), 149 (1), 180 (1), 212 (6), 354 (M+,13), 355 (2)。C18H14N2O4S的分析计算值：C,61.01; H,3.98; N, 7.90。测量值: C, 61.01; H, 4.02; N, 7.99。

1.3 化合物3a-3f的一般合成过程

将草酰氯(257 μL, 3.0 mmol, Acros Organics，比利时吉尔)加入 1,3-噻唑烷(1，1.0 mmol)的乙腈(12 mL，Cryochrom，俄罗斯圣彼得堡)溶液中，用力搅拌，然后在70 ℃搅拌反应混合物4 h，冷却至室温。过滤得到沉淀物，用水(10 mL)洗涤，干燥，在乙醇中(Rosbio，俄罗斯圣彼得)重结晶。

化合物(2E,5Z)-和(2Z,5Z)-3a数据：黄色粉末；收率：87% (258 mg)；熔点：277～284 ℃；红外光谱υ (cm-1)：3295 (NH), 1770 (C=O)(弱), 1741(C=O)(中),1693 (C=O) (强)；1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)：δ 3.07(s, 3H, NMe), 3.08(s, 3H, NMe), 3.88(s, 3H, OMe),3.88(s, 3H, OMe), 6.91(s, 1H, CH), 6.93(s, 1H, CH)。附加质子试验(APT)NMR (100 MHz, DMSO-d6)：δ 23.57(NCH3), 23.80 (NCH3), 52.88 (OCH3), 52.90 (OCH3),98.45 (C4′=), 98.46 (C4′=), 119.14 (C9=), 119.23 (C9=),139.17 (C5=), 139.45 (C5=), 158.37 (C2=), 158.63(C2=), 161.90 (C=O), 161.97 (C=O), 165.45 (C=O),165.79 (C=O), 165.82 (C=O), 167.10 (C=O), 167.22(C=O), 167.99 (C=O), 176.39 (C3′=O), 180.44(C3′=O)；电子电离质谱分析(70 eV, m/z相对强度)：39(14), 45 (6), 57(59), 59(46), 67(35), 71(17), 85(100),88(12), 94(15), 96(2), 116(68), 117(26), 118(5), 125(1),144(27), 145(3), 152(3), 153(2), 211(20), 212(2), 238(1),239(2), 265(1), 296(M+,11), 297(1)。C11H8N2O6S的分析计算值：C, 44.60; H, 2.72; N, 9.46。测量值：C, 44.22;H, 2.75; N, 9.30。

化合物(2E,5Z)-和(2Z,5Z)-3b数据：黄色粉末；收率：57% (212 mg)；熔点：212～215 ℃；红外光谱υ (cm-1)：3207 (NH), 1773 (C=O)(弱), 1727 (C=O)(中),1685 (C=O)(强)。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)：δ 3.82 (s, 3H, Me), 3.83 (s, 3H, Me), 4.73 (s, 2H, CH2),6.91 (s, 1H, CH), 6.93 (s, 1H, CH), 7.23～7.36 (m, 5H,Ph)。13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)：δ 40.84 (CH2),41.08 (CH2), 52.87 (OMe), 52.91 (OMe), 98.27 (C4′=), 98.32(C4′=), 119.15 (C9=), 119.22 (C9=), 127.42 (Ar), 127.47 (Ar),127.58 (Ar), 127.68 (Ar), 128.46 (Ar), 128.49 (Ar), 136.00 (Ar),136.04 (Ar), 139.40 (C5=), 139.65 (C5=), 159.67 (C2=),159.93 (C2=), 161.73 (C=O), 161.78 (C=O), 165.21 (C=O),165.84 (C=O), 167.68 (C=O), 167.88 (C=O), 167.88 (C=O),176.00 (C3′=O), 180.11 (C3′=O)；电子电离质谱分析(70 eV,m/z相对强度)：39 (10), 45 (4), 57 (12), 59 (20), 65 (24),70 (23), 85 (61), 86 (15), 91 (75), 94 (11), 106 (42), 116(42), 118 (4), 119 (2), 143 (30), 144 (34), 149 (7), 152 (3),171 (11), 172 (6), 211 (30), 212 (7), 229 (3), 238 (17),239(2), 255(2), 256(13), 281(19), 282 (3), 287 (2), 312(2), 315 (19), 316 (7), 341 (3), 344 (14), 345 (3), 372 (M+,100), 373 (21)。C17H12N2O6S的分析计算值：C, 54.84; H,3.25; N, 7.52。测量值：C, 54.79; H, 3.12; N, 7.26。

化合物(2E,5Z)-和(2Z,5Z)-3c数据：黄色粉末；收率：65% (233 mg)；熔点：230～232 ℃；红外光谱υ (cm-1)：3314 (NH), 1761 (C=O)(弱), 1748 (C=O)(中),1688 (C=O)(强)。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)：δ 3.83 (s, 3H, Me), 3.84 (s, 3H, Me), 6.94 (s, 1H, CH),6.96 (s, 1H, CH), 7.35～7.55(m, 5H, Ph)；13C NMR(100 MHz, DMSO-d6)：δ 52.9 (OMe), 52.9 (OMe), 98.3(C4′=), 119.5 (C9=), 126.8 (Ar), 126.9 (Ar), 128.4 (Ar),128.8 (Ar), 131.4 (Ar), 139.2 (C5=), 139.5 (C5=), 160.0(C2=), 160.1 (C2=), 160.8 (C=O), 160.8 (C=O), 164.5(C=O), 165.8 (C=O), 167.2 (C=O), 167.5 (C=O), 167.6(C=O), 175.8 (C3′=O), 179.9 (C3′=O)；电子电离质谱分析(70 eV, m/z相对强度)：39 (8), 45 (4), 57 (17), 59(23), 64 (15), 71 (10), 85 (61), 86 (20), 91 (31), 94 (6),116 (63), 117 (27), 119 (67), 120 (10), 144 (59), 145(6), 146 (4), 152 (5), 165 (1), 179 (2), 183 (2), 211(100), 212 (10), 288 (3), 330 (49), 331 (9), 358 (M+,56), 359 (12)。C16H10N2O6S的分析计算值：C, 53.63;H, 2.81; N, 7.82。测量值：C, 53.50; H, 2.69; N, 7.73。

化合物(2E,5Z)-和(2Z,5Z)-3d数据：黄色粉末；收率：74% (245 mg)；熔点：259～261 ℃；红外光谱υ (cm-1)：3202 (NH), 1777 (C=O)(弱), 1707 (C=O)(中), 1687 (C=O) (强)。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)：δ 3.81 (s, 3H, MeO), 3.82 (s, 3H, MeO), 3.84 (s,3H, MeO), 6.93(s, 1H, CH), 6.95(s, 1H, CH), 7.04～7.10 (m, 2H, Ar), 7.26～7.34 (m, 2H Ar)；13C NMR(100 MHz, DMSO-d6)：δ 52.91 (OMe), 52.95 (OMe),55.42 (OMe), 98.36 (C4′=), 114.12 (Ar), 119.35 (C9=),119.41 (C9=), 123.84 (Ar), 123.89 (Ar), 128.07 (Ar),128.17 (Ar), 139.53 (C5=), 139.26 (C5=), 159.03 (Ar),159.57 (C2=), 159.76 (C2=), 161.03 (C=O), 161.08(C=O), 164.75 (C=O), 165.85 (C=O), 167.37 (C=O),167.41 (C=O), 167.54 (C=O), 176.03 (C3′=O), 180.14(C3′=O)；电子电离质谱分析(70 eV, m/z相对强度)：39 (1), 51 (3), 59 (4), 63 (1), 64 (1), 78 (6), 85 (11), 90(2), 94 (2), 106 (10), 116 (5), 121 (3), 122 (2), 134 (26),135 (2), 149 (100), 180 (2), 211 (2), 360 (6), 361 (1), 388(M+, 19), 389 (4)。C17H12N2O7S的分析计算值：C, 52.58;H, 3.11; N, 7.21。测量值：C, 52.91; H, 3.07; N, 7.16。

化合物(2E,5Z)-和(2Z,5Z)-3e数据：砖红色粉末；收率：70% (286 mg)；熔点：278～280 ℃；红外光谱υ (cm-1)：3205 (NH), 1776 (C=O)(弱), 1724 (C=O)(中),1693 (C=O) (强)。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)：δ 3.80 (s, 3H, OMe), 3.86 (s, 3H, OMe), 6.92 (s, 1H,CH), 6.95 (s, 1H, CH), 7.49～7.70 (m, 4H, naph), 7.90～7.98 (m, 1H, naphthyl), 8.01～8.12 (m 2H, naphthyl)；

13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)：δ 52.90 (OMe),52.97 (OMe), 98.95 (C4′=), 119.36 (C9=), 119.43(C9=), 123.43 (Ar), 123.49 (Ar), 125.57 (Ar), 126.64(Ar), 126.90 (Ar), 126.95 (Ar), 128.14 (Ar), 128.37(Ar), 129.54 (Ar), 129.57 (Ar), 129.82 (Ar), 129.90(Ar), 133.70 (Ar), 139.39 (C5=), 139.59 (C5=), 159.73(C2=), 159.98 (C2=), 161.63 (C=O), 161.68 (C=O),165.03 (C=O), 165.86 (C=O), 165.92 (C=O), 167.67(C=O), 167.74 (C=O), 167.83 (C=O), 176.02 (C3′=O),180.14 (C3′=O)；电子电离质谱分析(70 eV, m/z相对强度)：39 (1), 45 (1), 57 (4), 59 (4), 63 (1), 71 (2), 85(11), 86 (3), 94 (1), 114 (11), 116 (6), 126 (1), 127 (3),140 (15), 141 (19), 169 (100), 170 (13), 190 (1), 211(2), 380 (5), 381 (1), 408 (M+, 20), 409 (5)。C20H12N2O6S的分析计算值：C, 58.82; H, 2.96; N,6.86。测量值：C, 58.48; H, 2.83; N, 6.97。

化合物(2E,5Z)-和(2Z,5Z)-3f数据：橙色粉末；收率：78% (319 mg)；熔点：278～281 ℃；红外光谱υ (cm-1)：3199 (NH), 1770 (C=O)(弱), 1750 (C=O)(中),1689 (C=O) (强)；1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)：δ 3.86 (s, 3H, OMe), 3.89 (s, 3H, OMe), 6.94 (s, 1H,CH), 6.96 (s, 1H, CH), 7.47～7.59 (m, 3H, naphthyl),7.89～8.03 (m, 4H, naphthyl)。13C NMR(100 MHz,DMSO-d6)：δ 52.87 (OMe), 52.92(OMe), 98.25 (C4′=),119.35 (C9=), 119.41 (C9=), 124.54 (Ar), 124.68 (Ar),125.42 (Ar), 125.57 (Ar), 126.75 (Ar), 126.90 (Ar),127.71 (Ar), 127.99 (Ar), 128.45 (Ar), 128.93 (Ar),139.37 (C5=), 139.65 (C5=), 160.42 (C2=), 160.56(C2=), 160.96 (C=O), 160.98 (C=O), 164.66 (C=O),165.83 (C=O), 167.36 (C=O), 167.78 (C=O), 167.96 (C=O),175.76 (C3′=O), 179.91 (C3′=O)；电子电离质谱分析 (70 eV，m/z相对强度)：39 (1), 57 (2), 59 (4), 63 (1), 71 (1),85 (11), 86 (3), 94 (1), 114 (11), 116 (7), 126 (1), 127(3), 140 (14), 141 (18), 169 (100), 170 (13), 190 (1),211 (1), 380 (6), 381 (1), 408 (M+, 26), 409 (6)。C20H12N2O6S的分析计算值：C, 58.82; H, 2.96; N,6.86。测量值：C, 58.80; H, 2.90; N, 6.69。

1.4 化合物4d的晶体结构测定

用牛津Xcalibur 3 (钼Kα辐射，λ=0.710 7 Å)(Wroclaw，波兰)衍射仪进行X-射线单晶衍射测定。图2所示化合物结构用SHELXS 97程序直接解析，再用SHELXL97进行基于F2的全矩阵最小二乘法修正。对非氢原子进行各向异性近似修正；氢原子以骑行模型进行各向同性精修。化合物3d的晶体学数据存于剑桥晶体学数据中心(CCDC 1523721)。

1.5 杀菌活性

测定了合成的所有化合物对马铃薯早疫病菌(RCAM 03318)、马铃薯干腐病菌(RCAM 0877)、丝核病菌(RCAM 01785)、晚疫病菌和马铃薯炭疽病菌(JS-171-5-76、JS-161-1)的离体杀菌活性。晚疫病菌为南开大学(中国天津)分离，炭疽病菌购自俄罗斯国家工业微生物所(俄罗斯莫斯科)，其他菌株购自俄罗斯国家农业微生物所(俄罗斯圣彼得堡)。

把病原菌接种于马铃薯葡萄糖琼脂(丝核病菌、马铃薯早疫病菌、晚疫病菌和炭疽病菌)或麦汁琼脂培养基(马铃薯干腐病菌)，25 ℃培养72 h。供试菌株在4 ℃培养基中保存。

图2 化合物3d的晶体结构

马铃薯葡萄糖琼脂的制备：去皮马铃薯(200 g)、葡萄糖(20 g)、琼脂(20 g)、蒸馏水(1 000 mL)。麦汁琼脂培养基制备：将啤酒糟麦芽汁用纱布过滤，添加 2%琼脂。对制备好的培养基进行高压灭菌(121 ℃，15 min)。

将50 mg化合物溶解在1 mL二甲基亚砜(DMSO)(Tatchempharmpreparaty，俄罗斯喀山)中，加入9 mL水，加热，超声，得到5 mg/mL溶液。在无菌条件下，用无菌软木打孔器在接种培养7 d的供试真菌培养基上制取直径4 mm、均匀的菌碟。在超净工作台中将1 mL供试溶液与9 mL加热到60℃的培养基混合均匀，把混合液倒入培养皿，冷却，凝固。将菌碟放置于培养皿中央。空白对照为仅添加DMSO的培养基。以Consento SC 450 [6.7% (w/w)咪唑菌酮和 33.6% (w/w)霜霉威混合物] (拜耳农作物科学公司，法国维尔弗朗什索恩)为阳性对照。每个化合物和对照处理设置3个重复。在25 ℃培养(丝核菌培养48 h，晚疫菌、干腐菌和炭疽病菌培养72 h，早疫病菌培养120 h)，培养结束后测定真菌菌落直径。根据Royse和Ries公式测定病原菌发育被抑制情况。

I (%)=[(C-T)/(C-4 mm)]×100

其中I (%)代表抑制径向生长的程度，T (mm)代表在每个特定浓度的化合物存在下菌落直径的平均值，C(mm)代表在相同的测定条件下空白对照菌落的平均直径。所有试验设置3个重复，计算平均值和标准偏差。

供试化合物4a-4f的致死中浓(EC50)通过相应的浓度对数-生长抑制率线性回归法计算所得。

2 结果与讨论

2.1 化学结构

烯酰胺与草酰氯的缩合反应直接合成了 2,4,5-三氧吡咯烷衍生物。为了证实该方法适用于各种烯酰胺，笔者使用2-甲基-1,3-噻唑烷-4-酮衍生物1a-1f作为起始原料。化合物 1a-1f通过前面描述的方法制备。硫代酰胺类化合物 2a-2f与炔基甲酸酯反应生成2-甲基-1,3-噻唑烷-4-酮类化合物1a-1f，产率为45%～80% (图3)。噻唑烷1a-1f的C-5位环外双键为Z构型。C-2位环外双键的构型取决于溶剂介质、分子内相互作用(氢键和弱的相互作用)和空间位阻。化合物1a-1f的1H核磁共振光谱表明在DMSO-d6溶液中( 2E,5Z )-1a-1f和( 2Z,5Z )-1a-1f异构体混合物共存，其中(2Z,5Z)-1a-1f异构体占主导。

图3 4-(4-氧代-1,3-噻唑烷-2-亚甲基)吡咯烷-2,3,5-三酮衍生物3a-3f的合成

1,3-噻唑烷-4-酮类化合物 1a-1f与草酰氯在70 ℃、干燥MeCN中成功反应，生成3a-3f粗产物，收率57%～87% (图3)。化合物3a-3f具有Z和E异构体，黄色或砖红色，具有较为宽泛的熔点范围。化合物3a-3f的结构通过红外光谱、质谱、1H和13C核磁共振、元素分析和X射线数据进行确定。质谱测定发现 3a-3f都具有一个分子离子峰(M+, 11%～100%)。羰基在1 770～1 777 cm-1表现出弱振动，1 724～1 748 cm-1表现中强度震动，1 685～1 693 cm-1表现出强震动。此外，化合物3d的单晶X射线衍射进一步证实了(2Z,5Z)-3d化合物(图2)的结构。

化合物3a-3f的1H和13C 核磁共振波谱显示每组为双信号。表1 (原子编号方案见图4 )列出了2个异构体的OMe和C(9)－H的特征信号。由于溶剂的快速交换，1H核磁共振谱上未发现NH基团信号。在室温，(2Z,5Z)-3a-3f和(2E,5Z)-3a-3f异构体的相互转换速度慢于核磁共振时标。在1H核磁共振变温试验(DMF-d7)中，化合物3a在δ 3.10、3.11 ppm 2个信号峰随着温度的升高越来越近，最后合为一峰(图5)。C5=C9键的存在降低了C2=C4键的推拉效应，阻碍(2E,5Z)-3和(2Z,5Z)-3异构体的相互转换。13C 核磁共振光谱在 δ 179.9～180.1、175.8～176.1 ppm的特征信号归属于 C(3′)=O羰基。正如笔者之前报道的，4-(4-氧代-1,3-噻唑烷-2-亚甲基)吡咯烷-2,3,5-三酮只呈现一组平均信号，在δ 179～180.1未发现低场信号。此外，2,4,5-三氧吡咯烷酮基团在185～206 ppm有信号。而参与烯醇化和分子内氢键形成的氧代基团(oxo group)碳原子明显更不被屏蔽。文献材料证实了2,4,5-三氧吡咯烷的这种现象。就(2E,5Z)-3a-3f的结构来说，C3′羰基信号向低场位移可被解释为NH•••O=C3′分子内氢键的形成与烯醇化反应可能性低的原因。因此，高场信号归属于(2Z,5Z)-3a-3f构象的C3′羰基。

表1 构型异构体3a-3f的1H和13C 核磁共振化学位移(δ,单位ppm)

图4 4-(4-氧代-1,3-噻唑烷-2-亚甲基)吡咯烷-2,3,5-三酮3a-3f异构化的一般途径

2.2 杀菌活性

测试了 2,4,5-三氧吡咯烷-3-亚甲基-4-氧代-1,3-噻唑烷-5-亚甲基类化合物 3a-3f对造成全球马铃薯减产的5种马铃薯病原菌的杀菌活性。为了进行对比，以对马铃薯和番茄霉病(晚疫病)有内吸活性，并对马铃薯早疫病有预防效果的商品杀菌剂 Consento SC 450作为阳性对照。Consento是霜霉威盐酸盐和咪唑菌酮混合杀菌剂。咪唑菌酮是咪唑啉酮类内吸性叶用杀菌剂，用于防治卵菌纲病害，比如早疫病和晚疫病。霜霉威盐酸盐是对藻菌纲病菌(腐霉菌属和疫霉菌属)具有预防作用的内吸性杀菌剂。

图5 测定化合物3a (DMF-d7)的变温1H核磁共振谱

试验发现所有 3a-3f化合物对供试菌株都有不同程度的活性(表2)。苄基连于2,4,5-三氧吡咯环的2,4,5-三氧吡咯烷-1,3-噻唑烷 3b化合物对所有菌株均表现出最佳的抗菌活性。该化合物对干腐病菌、核丝菌和晚疫病菌的径向生长抑制效果优于阳性对照，对早疫病菌的活性与阳性对照相似。因此，以2,4,5-三氧吡咯烷的 N取代结构在抗菌活性中起主要作用。

表2 化合物3a-3f对马铃薯植物病原菌的抑制活性

评估了化合物 3a-3f对植物病原真菌和卵菌亚纲真菌(晚疫病菌)的毒性(表 3)。结果显示，化合物3b抗真菌活性最好，EC50为0.052～0.445 mg/mL。2,4,5-3氧吡咯烷-1,3-噻唑烷化合物3b对马铃薯早疫病菌和晚疫病菌表现出最高的活性。因此，化合物3b很有潜力进一步开发为新型杀菌剂。

表3 化合物3a-3f的致死中浓度