微RNA-502在胃癌中的表达及其临床意义

刘吴瑕 施 洪 李秀林 罗天航 彭小波

胃癌是常见的恶性肿瘤，2012年在全球癌症相关死亡中排名第3位，死亡人数达到723 000例［1］。我国胃癌发病率和病死率均位居恶性肿瘤的第2位［2-3］。胃癌在组织学上存在高度异质性，阐明胃癌发病的分子机制是提高其治疗率、改善患者预后的关键。国内外研究结果表明，胃癌发生和发展与多种微RNA（mi RNA）的异常表达相关。mi RNA通过调控细胞分化和凋亡来影响恶性肿瘤的发生、发展。mi RNA可能成为肿瘤治疗的新靶点［4-5］。本研究旨在分析mi RNA-502的表达及其与胃癌临床病理特征的关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象 本研究经上海长海医院伦理委员会讨论通过。收集2017年10月—2018年3月在上海长海医院普外科进行手术治疗的28例胃癌患者的病史资料和手术标本，所有标本均经病理学检查诊断证实。全部入组患者手术治疗前均未行化学治疗（以下简称化疗）或放射治疗（以下简称放疗）。所有患者均签署知情同意书。

1.2 标本收集 所有入组的胃癌患者在术前抽取2 mL外周静脉血测定癌胚抗原（CEA）和糖类抗原19-9（CA19-9）水平。手术标本在离体30 min内送至上海长海医院病理科，进行常规的病理学检查、免疫组织化学（以下简称免疫组化）染色。人表皮生长因子受体（HER）-2扩增状态判定标准：HER-2蛋白质免疫组化染色结果示＋＋＋为有扩增，-或＋为无扩增；若HER-2蛋白质免疫组化染色结果为＋＋，则进一步行HER-2基因荧光原位杂交（FISH）检测，若FISH检测结果为红色信号的总数与绿色信号的总数比值≥2为有扩增，＜2为无扩增。按照美国癌症联合会（AJCC）肿瘤分期手册（第八版）进行胃癌临床分期。取患者的胃癌组织和距离癌边缘＞5 c m的正常黏膜组织（癌旁组织），经液氮处理后于-80℃贮存，检测mi RNA-502相对表达量。

1.3 实时定量PCR检测mi RNA-502的相对表达量 常规提取胃癌组织、癌旁组织中的RNA，用mi RNA反转录试剂盒合成互补DNA（c DNA）。用SYBR Premix ExTaqTM试剂盒进行实时定量PCR。TRIzol RNA提取试剂购自美国Invitrogen公司；实时定量PCR试剂盒和SYBRⓇPremixTaq购自日本Ta KaRa公司。以U6作为内参照，应用ABI7900实时荧光定量PCR仪自带软件分析，获得扩增产物Ct值，Ct为反应的实时荧光强度达到设定的阈值时所经过的扩增循环数，结果采用2一△△Ct法分析mi RNA的相对表达量。mi RNA-502正向引物为5'-CGG GCA TCC TTG CTA TCT G-3'，反向引物为5'-CAG CCA CAA AAG AGC ACA AT-3'；内参U6正向引物为5'-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3'，反向引物为5'-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3'。PCR扩增mi RNA反应条件：95℃预变性5 min；95℃变性10 s，60℃退火30 s，40个循环；最后72℃延伸8 min，于4℃保存。实验重复3次取平均值。

1.4 mi RNA-502相对表达量的比较 比较胃癌组织与癌旁组织中mi RNA-502的相对表达量。比较不同性别、年龄（≤60岁和＞60岁）、癌组织HER-2蛋白质表达（扩增和未扩增）、血清CEA（＜5μg/L和≥5μg/L）、血清CA19-9（＜39 U/mL和≥39 U/mL）、胃癌T分期（T1～2期和T3～4期）、淋巴结转移（有或无）患者癌组织mi RNA-502的相对表达量。

1.5 统计学处理 应用Graph Pad Pris m 5.0和SPSS 19.0统计学软件。呈正态分布的计量资料以±s表示，配对资料的比较采用配对t检验，不同临床病理特征患者的胃癌组织mi RNA-502相对表达量的比较采用t检验。多因素分析采用COX多元回归模型。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 胃癌组织和癌旁组织中mi RNA-502的相对表达量 癌旁组织、胃癌组织中mi RNA-502的相对表达量分别为3.66±1.99、1.97±1.82，胃癌组织中mi RNA-502相对表达量显著低于癌旁组织（P＜0.01）。

2.2 不同临床病理特征的胃癌患者癌组织的mi RNA-502的表达 28例入组患者的中位年龄为67岁。T1～2期和无淋巴结转移患者癌组织中mi RNA-502的相对表达量分别显著高于T3～4期（P＜0.001）和有淋巴结转移（P＝0.03）的患者，而不同年龄、性别、癌组织HER-2蛋白质表达、血清CEA和血清CA19-9水平的患者癌组织中mi RNA-502相对表达量的差异均无统计学意义（P值均＞0.05），见表1。

2.3 mi RNA-502的表达与胃癌临床病理特征关系的多因素分析 将上述因素导入COX多元回归模型，结果显示，mi RNA-502的表达量与胃癌T分期显著相关［风险比（HR）＝1.62，95%CI为1.34～1.96，P＝0.028］，而与年龄、性别、癌组织 HER-2蛋白质表达、血清CEA水平、血清CA19-9水平和淋巴结转移状态均不相关（P值均＞0.05）。

表1 不同临床病理特征的胃癌患者癌组织mi RNA-502的表达比较（N＝28，±s）

表1 不同临床病理特征的胃癌患者癌组织mi RNA-502的表达比较（N＝28，±s）

临床病理特征 nmi RNA-502相对表达量 P值17 2.24±1.90 0.15女11 1.38±0.83年龄≤60岁 9 1.36±1.12 0.23＞60岁 19 2.16±1.89癌组织HER-2蛋白质表达无扩增 24 1.80±1.58 0.46扩增 4 2.47±1.43血清CEA水平＜5μg/L 20 2.13±1.33 0.25≥5μg/L 8 1.34±0.91血清CA19-9水平＜39 U/mL 21 2.15±1.70 0.10≥39 U/mL 7 1.15±0.81 T分期T 1～2期 4 4.87±1.55 ＜0.001 T 3～4期 24 1.40±1.00淋巴结转移无4 3.47±2.46 0.03有性别男24 1.64±1.19

3 讨 论

胃癌发病率和恶性程度均位居恶性肿瘤前列，严重危害人类身体健康，也给社会和家庭带来了沉重的经济负担。胃癌的发生和发展是受遗传、环境、饮食、生活习惯等多因素影响的复杂过程，受到多种基因调控，涉及多个基因的表达或者失活［6-8］。

mi RNA是非编码的内源性单链小分子RNA，广泛存在于多种真核生物中，通过结合特定靶基因信使RNA（mRNA）的3'非编码区，调控基因转录后的表达，在基因翻译水平实现对靶基因表达的负调控，并可以通过特定机制，参与肿瘤的发生和演进。成熟的mi RNA含20个碱基，具有调节基因表达活性的功能［9］。研究［10］结果表明，mi RNA作为一种重要的转录后调控因子，广泛地参与肿瘤相关基因的调控，在肿瘤的诊断、治疗方面扮演重要角色。

近年发现，mi RNA与胃癌患者淋巴结转移、疾病进展、复发、生存时间均存在相关性。Chen等［11］研究发现，有远处转移的胃癌患者血浆mi RNA-122水平显著降低，mi RNA-192的水平显著升高（P＜0.01）；Cox回归分析结果显示，血浆mi RNA-122高表达是胃癌预后较好的独立预测因素，而mi RNA-192水平与患者总生存期无相关性。Yan等［12］发现mi RNA-335可以作为鉴定胃癌是否复发的指标，其灵敏度和特异度分别为0.871和0.791。Zhang等［13］观察胃癌患者术后血浆mi RNA的水平发现，与低mi RNA-375且高mi RNA-142-5p表达的患者相比，高mi RNA-375且低mi RNA-142-5p表达的患者中位生存期明显缩短，表明联合mi RNA-375和mi RNA-142-5p可以预测手术切除后胃癌患者的疾病进展。Qiu等［14］发现，mi RNA-26a和 mi RNA-148a的下调与患者总生存期缩短显著相关（P＝0.011），且Cox回归分析结果表明两者均是胃癌的独立预后因素。因此，在胃癌的发生、发展过程中，研究mi RNA及其相关的调控机制有切实的临床意义。

既往研究［15］结果提示，mi RNA-502可以通过抑制自噬来抑制结肠癌细胞增殖；mi RNA-502在乳腺癌中的表达水平显著低于癌旁组织，通过下调肿瘤坏死因子受体相关因子2（TRAF2）发挥促进乳腺癌细胞凋亡和抑制乳腺癌细胞增殖的作用［16］。Chen等［17］发现，mi RNA-502表达下调与肝癌的发生、发展相关，mi RNA-502通过靶向下游磷脂酰肌醇3-激酶γ（PIK3CG）抑制肝癌细胞增殖、G1/S期细胞周期阻滞和促进肝癌细胞凋亡。

目前，鲜见mi RNA-502在胃癌中的研究。本研究通过实时定量PCR方法检测28例胃癌及其癌旁组织中的mi RNA-502表达，发现癌组织中mi RNA-502的表达显著低于癌旁组织，这与之前的mi RNA-502在结直肠癌、乳腺癌和肝癌中的报道一致［15-17］。进一步比较不同年龄、性别、癌组织HER-2蛋白质表达、血清CEA、血清CA19-9、胃癌T分期，以及有无淋巴结转移患者的胃癌组织中mi RNA-502表达量，结果提示mi RNA-502的相对表达量与肿瘤T分期、淋巴结转移情况显著相关。进一步行多因素分析显示，mi RNA-502的表达量仅与胃癌T分期显著相关，而与其他因素均不相关。研究结果表明，在胃癌的发展过程中mi RNA-502逐渐丢失，mi RNA-502在胃癌发病中可能起到抑癌基因作用。

本研究初步探讨了mi RNA-502在胃癌中的表达及其与主要临床病理特征的关系，但关于mi RNA-502在胃癌的发生、发展中的具体表达变化，及其相关的调控机制目前仍有待于进一步研究确定。能否为胃癌的诊断和进展判断提供一个新的潜在的标志物，则期待更大样本的研究。