胰腺β细胞再生研究进展

洪育蒲 石乔 王卫星

武汉大学人民医院普通外科 消化系统疾病湖北省重点实验室，武汉 430060

【提要】 胰腺由外分泌部和内分泌部组成，包括胰岛素在内的多种代谢性激素由胰岛的内分泌细胞合成。胰岛的再生能力在出生后明显受限，糖尿病导致的β细胞损伤后需要干预治疗来促进β细胞再生修复，目前主要是通过移植人类胰岛及人多能干细胞来源的β细胞进行补充；其他方法包括刺激内源性β细胞增殖，促进其他细胞转化为β细胞，以及从基因工程动物中获取胰岛。

胰腺是控制能量消耗和代谢的核心器官，主要由包括腺泡和导管的外分泌部与胰岛为主的内分泌部构成。腺泡细胞产生一系列消化酶，包括脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶，以降解脂肪、蛋白质和碳水化合物。胰岛5种内分泌细胞各分泌一种激素，分别为胰岛素(β细胞)，胰高血糖素(α细胞)，生长抑素(δ细胞)，胰多肽(PP细胞)和胃饥饿素(ε细胞)。其中胰岛素和胰高血糖素直接经过致密的胰岛内血管网释放入血，在维系血糖稳态中起到关键作用。在胰腺炎和糖尿病过程中，炎性刺激、高血糖、高血脂以及胰岛淀粉样多肽引起内质网应激和氧化应激，使腺泡细胞与β细胞的结构和功能受损[1-4]。糖尿病是世界上主要的健康问题之一，多种并发症造成了沉重的社会和经济负担。其中以胰岛素抵抗为主的2型糖尿病占大多数，研究表明，相对于正常人，2型糖尿病患者存在胰岛β细胞数目减少[5]。1型糖尿病是一种自身免疫性疾病，所占比例为5%～10%，患者β细胞选择性被破坏后导致严重的胰岛素缺乏，必须依赖于胰岛素替代治疗。

近几十年来，糖尿病患者逐年增加，许多研究集中在胰腺发育、稳态和再生领域。在生理状态下，成人胰腺能否自发再生β细胞仍有待探索。增强或诱导胰岛的固有再生能力，发明新方法增加分泌胰岛素的β细胞数量对于治疗糖尿病有着重要意义。本文就胰腺β细胞再生修复的研究进展作一综述。

一、胰岛再生动物模型

由于糖尿病的重要影响，有关胰腺再生的研究主要集中在胰岛再生领域。胰岛再生的研究依赖于动物损伤模型，这些模型包括胰腺切除、胰管结扎、胰岛细胞化学性损伤等。研究发现，大鼠胰腺切除90%并不影响血糖稳态，提示剩余的胰岛以强大的代偿能力足以维持血糖水平[6]，而在未成年的啮齿类动物胰腺切除后，观察到在切口处发生组织再生。然而，人的胰腺切除50%～60%将诱发胰岛素依赖型糖尿病[7]。仅有少数儿童行胰腺切除后发生了组织再生，胰腺再生能力随着增龄急剧下降，成年后胰腺再生能力消失[8]。

另一种动物损伤模型是胰管结扎后模拟梗阻性胰腺炎，这种模型造成小鼠腺泡细胞广泛死亡，但是胰岛并未受损，也未见明显的胰岛再生[9]。此外，应用链佐菌霉素或四氧嘧啶作为化学性毒素制备模型，结构性模拟葡萄糖进入成年动物β细胞并选择性破坏部分或全部的β细胞。尽管在这些动物损伤模型中也未见β细胞再生[10]，但是在妊娠、肥胖或者胰岛素抵抗情况下可以观察到胰岛增生[11-12]。

二、新生胰腺β细胞的方法

鉴于糖尿病患者数量众多，对β细胞再生治疗有着巨大的临床需求。修复有功能的β细胞群，使得患者免于每日注射胰岛素，有助于减少因胰岛素剂量控制不佳导致的严重并发症。由于1型糖尿病主要集中在青少年，β细胞的严重缺乏引起的血糖异常可能危及生命，对于β细胞再生治疗的需求尤为迫切[13]。

尸体来源的胰岛移植使得1型糖尿病患者获益，并有部分患者维持多年无需胰岛素替代治疗[14]。然而，由于合适的供体来源有限以及需要长期进行免疫抑制治疗，尸体来源的胰岛移植范围受限。为了让更多的患者受益，拥有可靠的标准化的人工胰岛以供移植之用，又不需免疫抑制治疗是最佳选择。另外，通过干预治疗刺激内源性的β细胞再生也是不错的选择。

1．促进干细胞分化：有研究在成年动物和人类胰管及其周围观察到单个β细胞和小胰岛的存在，提示成年的动物或者人类胰腺存在着干细胞或祖细胞[15]。此外，在胰管结扎的小鼠导管结构中观察到少量的神经元素3阳性的内分泌前体细胞[16]，并在α细胞向β细胞转化模型中也观察到胰岛和导管周围有神经元素3阳性细胞存在[17]。

在对青蛙、鱼类及小鼠这些动物幼年时期的研究中已经获知从受精卵到成熟胰岛发育过程涉及的关键步骤和信号通路[18-19]。从体细胞中诱导多能干细胞(iPSCs)实现突破，为产生患者所需要的特殊细胞群提供了新思路[20]。从人胚胎干细胞中获得胰腺内分泌细胞，需首先用信号分子引导人胚胎干细胞定向分化，然后依次形成终末内胚层、胰腺上皮、内分泌祖细胞和胰岛素阳性细胞[21]。诱导方案进行优化后，在体外成功促使人胚胎干细胞、iPSCs及胰十二指肠同源盒1(PDX1)阳性的祖细胞分化成对葡萄糖敏感的胰岛细胞群，这些细胞群在形态和功能上与胰岛相似，并在体内进一步成熟，对小鼠糖尿病模型起到治疗作用[22-24]。在体外培养获得包括β细胞和其他内分泌细胞的细胞群，如果能够进一步获得含有血管内皮细胞和成纤维样细胞的细胞群，将更接近天然胰岛。

尽管目前在干细胞研究中取得了显著的进展，在促进干细胞分化成熟、减少杂质细胞、避免排斥反应等方面仍需继续探索。

2．β细胞自我复制：刺激β细胞增殖是简单而直观的补充β细胞群的方式。大量的生长因子和促有丝分裂物质被证实能促进动物的β细胞增殖，包括甲状旁腺激素相关蛋白、肝细胞生长因子、胰高血糖素样多肽、胰岛素样生长因子、胃泌素、表皮生长因子、血小板源性生长因子以及腺苷酸激酶抑制剂等[11-12,25-26]，但是这些物质并不能有效刺激人β细胞增殖。生理情况下，β细胞再生能力随着增龄显著降低，在年轻的啮齿类动物中β细胞维持着较高的增殖率，在1月龄大鼠中每天大约是4%，七月龄大鼠仅为0.5%[27]。人β细胞的大量增殖存在于幼年时期，特别是出生后1年内[28-30]。在正常、妊娠、肥胖成人的胰腺标本中很少检测到β细胞复制的现象[31-32]。

人和小鼠的胰岛存在着结构和分子水平上的差别。小鼠的β细胞主要集中在胰岛中央，而人类的β细胞在胰岛中均匀分布。人类的β细胞以葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)和GLUT2作为主要的葡萄糖转运子，而且表达肌腱膜纤维肉瘤癌基因同系物B(MAFB)这种在小鼠β细胞中不表达的因子[33-34]。尽管人β细胞存在控制细胞周期必需的分子元件(细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶等)，但是在妊娠、肥胖和胰岛素抵抗状态下，人β细胞并不能像小鼠或大鼠的β细胞那样发生增殖。通过直接调节上述分子元件或者基因突变可以促使体外培养的人类β细胞进行增殖[35-36]。另外，许多细胞周期因子被限制在成熟β细胞的胞质中，无法转移到胞核内启动细胞分裂程序[37]。在肥胖或胰岛素抵抗时升高的血清胰岛素和葡萄糖可能刺激β细胞增殖[38-39]，但具体的关键信号仍不清楚。多项研究通过化合物高通量筛查发现，双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1A( DYRK1A)抑制剂可以有效刺激体外培养的人β细胞和体内移植的人β细胞进行增殖[40-42]。此外，包括钙调磷酸酶和丝氨酸蛋白酶抑制剂B1在内的相关通路也被发现[43-44]。但是这些化合物的应用大多伴随着其他细胞的增殖，在细胞类型特异性、靶向干预胰岛等方面仍需进一步论证，以保证这些化合物作用于细胞周期过程中不会诱发肿瘤形成。

3．其他细胞向β细胞转化：体细胞核移植为重新编程每个细胞成为其他类型细胞提供了可能[45]。相应地，应用β细胞发育的主要调节因子促使非β细胞转化为胰岛素阳性细胞引起了研究者极大的兴趣。将神经元素3、PDX1、肌腱膜纤维肉瘤癌基因同系物A(MAFA)三者组合的腺病毒载体导入到成年小鼠胰腺中可以有效促使腺泡细胞转化为胰岛素阳性细胞[46-47]，由此产生的胰岛素阳性细胞能维持长时间的稳定性并改善糖尿病。肠道上皮细胞和胃窦细胞也可以转化为胰岛素阳性细胞[48]。另外，神经元素3阳性的小肠内分泌祖细胞条件性敲除叉头框转录因子(FOXO1)后也形成了胰岛素阳性细胞[49]。这些研究提示胃肠道上皮细胞通过重新编程可能成为功能性β细胞的来源。还有细胞因子调节的腺泡细胞[50]、FBW7(F-box and WD repeat domain-containing 7)敲除的导管细胞[51]及转录生长因子β诱导因子2(TGIF2)过表达的肝细胞[52]亦可转化为胰岛素阳性细胞。

胰岛周围有独特的胰岛素阳性细胞群被认为是α细胞向β细胞的过渡状态[53]。γ-氨基丁酸(GABA)可以促进α细胞向β细胞转化，长期的GABA处理有利于增加β细胞群数量[17]。将包含PDX1和MAFA表达组件的腺病毒载体导入体外培养的小鼠和人类胰岛中，可以观察到α细胞向β细胞转化[54]。多项研究表明，包括腺泡细胞、导管细胞、胆囊细胞及小肠细胞在内的多种细胞可转化为胰岛素阳性细胞，但并不能形成稳定的移植体，可能与不完全转化或者表观遗传不稳定有关[55-56]。基于这些问题，将重编程方法应用到临床的主要挑战就是如何优化编程方案来形成稳定而有功能的移植体。

4．基因工程动物获取胰岛：有关以猪胰岛为主的胰岛异种器官移植方面的探索性研究已经进行了数十年[57]。异种移植物的免疫排斥反应和大量的猪逆转录病毒明显阻碍了移植的成功。有研究应用CRISPR-Cas9基因编辑技术将62个已知的猪逆转录病毒从皮肤细胞中敲除，并将这类皮肤细胞制成iPSCs，制备猪胰岛移植供体[58-59]。为保持猪来源胰岛的长期存活和正常发挥功能，依赖于包裹技术的进步以保护移植物免受人体免疫排斥。

5．促进β细胞再分化： 长期的高血糖和高血脂环境、慢性胰腺炎或胰腺癌导致的胰腺炎性环境及自身免疫性炎症等应激状态均可导致胰腺β细功能失调，发生β细胞脱颗粒，甚至基因表达下调。β细胞去分化后将表达胰岛祖细胞标记物神经元素3[60]。目前，功能失调的β细胞是否普遍存在去分化，去分化过程在人类β细胞中是否可逆，均尚不清楚。在2型糖尿病患者通过饮食、运动、胰岛素强化治疗可以促使功能失调的β细胞恢复胰岛素分泌能力。那么，寻找促使去分化β细胞发生再分化的药物将成为糖尿病新的治疗方式，并作为一种不产生新细胞的独特的细胞再生方式。

三、细胞再生治疗面临的挑战

为了保护尸体来源的β细胞移植物发挥功能，受体可以应用免疫抑制药物减少排斥反应，但是不可避免地对β细胞产生不良反应。另外一种方法是应用生物工程材料制成微囊包裹移植的β细胞，将β细胞与免疫细胞隔离，但是这也不可避免地将其与血管隔离，并改变了β细胞对葡萄糖的敏感性及对氧和营养物质的利用，对β细胞的长期生存和发挥功能将产生不利影响。为解决这些问题，一系列创新型材料被研发出来[61-62]。此外，在非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠模型中，多种免疫疗法被证实可以改善甚至完全阻止免疫攻击[63]，但是在临床试验中，这些方案并不能使患者从中获益。通过基因修饰胰岛细胞群或者操纵受体的免疫系统等方法可能成为减轻免疫攻击的另一途径。

那么，获得天然免疫耐受的β细胞移植物将是未来研究的方向。在长期1型糖尿病的患者胰岛中意外发现有β细胞仍表达胰岛素，并对葡萄糖刺激敏感，提示这些细胞可能逃避了自身免疫攻击而继续发挥生理功能[64]。最近研究发现，正常的小鼠和人类胰岛β细胞在分子和功能方面均存在着异质性，并分为多个亚群[65-66]，其中存在着作为启动胰岛素脉冲式释放的起搏中心的β细胞亚群。针对人胰岛标本的深入研究，可以更深刻地认识人β细胞的异质性，以期获得可以逃避自身免疫攻击的β细胞。此外，来源于iPSCs的患者特异性细胞群可能是解决免疫排斥和增加免疫相容性的有效手段。

四、小结与展望

基于胰腺胚胎发育及生理和病理状态下胰腺再生反应的研究，制定胰腺β细胞再生策略将有着重要的指导意义。例如对胚胎发育过程中胰岛形成的研究有助于促使人胚胎干细胞分化为胰岛细胞群；对出生后胰岛从不成熟过渡到成熟状态的深入了解，将有助于在体外培育成熟的β细胞；探索调控肥胖和胰岛素抵抗时胰岛细胞群生理性增殖的信号通路，有助于研发促进β细胞增殖而避免癌变风险的药物。单细胞分析将为研究正常和病理情况下的胰岛细胞异质性、寻找免疫耐受的少数内分泌细胞、明确人胚胎干细胞如何过渡到成熟β细胞、以及非β细胞转化为β细胞等提供新的线索。在单细胞水平的活细胞成像技术将使得体内固有胰岛的钙离子波、胰岛素释放及免疫相互作用可视化。

近年来虽然在胰腺再生方面有着显著进步，但是仍有一些问题亟待阐明。人类胰腺自然再生和修复的机制如何？在功能性和免疫性方面，胰腺β细胞的异质性有何表现？厘清这些问题，将为未来研制出具有天然抵抗或者逃避自身免疫攻击特性、无需材料包裹或者免疫抑制药物的β细胞移植物奠定基础。这不仅将使得糖尿病患者获益，也将为其他自身免疫性疾病患者的治疗提供新思路。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突