TLR4对缺血再灌注损伤作用机理的研究进展

杨莹莹，王 猛，刘 霞，张玉华，顾萍萍，张云杰

Toll受体(TLRs)是先天性免疫应答的代表性受体，它可识别病原相关分子模式(PAMPS)，引导信号传导通路，介导炎症的发生，激活天然免疫反应，并且可以提供共刺激信号，启动机体的获得性免疫反应。目前关于缺血再灌注损伤的发病机理仍未明确，但仍有许多证据表明，与TLRs关系密切，其中以Toll-样受体4（toll-like receptor 4，TLR4）所起作用的研究最为普遍，本文就以近年来TLR4在缺血再灌注损伤中应用的研究进展作一综述。

1 TLR4的结构及其信号传导通路

1980年，Nusslein-Volhard等[1]在对果蝇胚胎发育过程的研究中，第一次发现并命名了Toll基因。1996年，通过研究具有突变的果蝇，Jules Hoffmann等[2]证明了Toll基因的活性，从而确立了Toll的免疫学意义。随后，在1997年Medzhitov等[3]人在哺乳动物体内发现了第一个TLR相关蛋白，即TLR4受体。迄今为止，我们已在不同的物种发现了至少15 种TLR，其中TLR4 是最早发现且研究最深入的。

1.1 TLR4的结构 TLR4的组成部分主要有三个，包括细胞外区域、跨膜区域和细胞内区域，其中胞外区主要用于特异性识别病原体及其产物，胞内区主要参与对下游相关信号的激活作用。TLR4几乎分布于人类所有的细胞系，其中在骨髓单核细胞、外周血白细胞和淋巴样组织中的表达最为丰富[4]。TLR4作为一种模式识别受体，不仅可以识别外源性配体，如革兰阴性菌的脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）、呼吸道合胞病毒融合蛋白、真菌表面的多聚糖；还可识别一些内源性配体，如高迁移率 族 蛋 白 1(high mobility group box-protein 1，HMGB1)、热休克蛋白60等[5]。

1.2 TLR4的信号传导通路

1.2.1 细胞内的信号转导部分 TLR4的信号传导途径可根据不同的接头分子分为两种[6]。一是以MyD88为接头分子的MyD88依赖的信号通路 （MyD88-dependent path-way），包括2条不同途径的信号转导。其中一条是以NF-KB信号通路为引导，完成的炎症信号的转导。另一条通路—MAPK信号通路，是通过三级激酶级联的方式来调控炎症基因转录。二是以TRIF为接头分子的非MyD88依赖的信号通路（MyD88-independent path-way），亦可以通过影响下游 NF-KB 的表达来介导炎症的发生还可以通过对TRIF/IRF3的激活来实现基因的转录。

1.2.2 细胞外的信号传导部分 LPS作为TLR4的主要识别配体，是革兰阴性细菌细胞壁中的一种主要成分，由O-抗原、核心多糖和脂质A组成。它可在髓样分化蛋白-2的协助下完成TLR4的活化，从而实现信号转导[7]。

2 缺血再灌注损伤

缺血再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury，IRI）又称再灌注损伤，是指组织器官（包括心、肝、肺、肾、胃肠道等）在缺血一段时间，血流恢复正常之后，细胞功能、代谢障碍及结构破坏非但没有恢复，反而比缺血时损伤的更严重。

1955年，Swell等[8]在动物实验中首次发现，在结扎狗的心脏冠状动脉后，如果结扎突然被解除，随后恢复血流，就会出现一些动物当即产生室颤而死亡的现象。1960年，Jennings等[9]通过实验发现并初次提出了心肌缺血再灌注损伤。此后，关于其他器官缺血再灌注损伤的研究报道愈来愈多。

缺血再灌注损伤的发病机理极其复杂，依托大量的实验和临床研究，目前大多数学者认为，再灌注损伤的发生主要与炎性反应、自由基生成过多、细胞内Ca2+超载、兴奋性氨基酸毒性和细胞凋亡等多种机制有关。而各种机制之间又密切维系，相互影响，最终促成了缺血再灌注损伤的发生、发展。

3 TLR4对各器官缺血再灌注损伤的应用进展

3.1 心肌缺血再灌注损伤 随着人们对心肌缺血再灌注损伤发生机理研究的深入，TLR4介导的信号通路在其中的作用渐渐明了。Oyama[10]对缺乏TLR4表达的小鼠和TLR4表达正常的小鼠分别进行了心肌缺血再灌注试验，对照结果发现，TLR4信号通路缺失可减少小鼠缺血再灌注后发生心肌梗死的概率。而Li等[11]的研究表明，短暂的心肌缺血会通过MyD88依赖的信号通路引起IRAK-1的活化，从而证实了TLR4介导的信号通路在缺血再灌注损伤时对心肌细胞凋亡和炎症起重要作用。

同时也有研究表明，TLR4通过诱导性一氧化氮合酶和可溶性鸟苷酸环化酶依赖机制对心肌缺血再灌注损伤提供了强有力的保护，这为抗缺血心肌保护提供了一种选择性靶向TLR4-MyD88信号的治疗策略[12]。Wang等[13]的紫檀芪对照实验更是证实，抑制TLR4/NF-KB信号通路后，可以减少缺血再灌注后的细胞凋亡及炎症反应。

随后越来越多的研究证明，不同物质通过抑制或激活TLR4 介导的信号通路可达到保护缺血再灌注损伤心肌的作用。然而，目前对于能否通过抑制TLR4信号通路来缓解心肌炎症并保护心脏功能还存在着质疑。Kim等[14]研究表明，TLR4缺陷小鼠在缺血再灌注损伤后，其血清细胞因子水平降低和心肌梗死面积减小，但是心脏功能并未恢复。而Fallach等[15]的实验结果则表明，TLR4可减少随后的心肌梗死并改善心脏功能。因此，在调节TLR4信号传导通路并避免在缺血再灌注时损伤心肌的同时，还需如何调节免疫功能是需要进一步研究的重要问题。

3.2 脑缺血再灌注损伤 脑缺血再灌注损伤引起的脑损伤是一种复杂的过程，其中炎症反应主要依赖于Toll受体中的TLR4，特别是一些内源性配体、HMGB1、过氧化物还原酶家族蛋白都参与了浸润巨噬细胞的激活和炎性细胞因子的表达，从而启动炎性级联反应，在脑缺血再灌注损伤的发生、发展过程中发挥关键性用途[16]。

多项研究表明，在脑缺血再灌注损伤发生时，TLR4可通过MyD88通路与TRIF通路加重脑组织的损伤[17]。有研究表明，TLR4通过MyD88依赖通路参与的免疫炎症反应，在大脑缺血再灌注早期可减轻脑组织损伤，而后期加重脑组织损伤[18]。

虽然其具体机制仍不明确，但却为以TLR4为靶点的治疗提供了指导意义。如Hua等[19]的研究证明，TAK-242可以通过抑制TLR4介导的信号通路和炎性细胞因子的表达，保护大脑免受缺血再灌注后的急性期损伤。有研究表明，羟基红花黄色素可以通过抑制TLR4诱导的先天免疫通路来减少脑缺血损伤，从而改善神经功能缺陷[20]。在脑缺血前予以电针刺激后，可以发现TLR4、NF-KB蛋白表达明显减少，炎性损伤减轻，神经功能缺损得到明显改善。提示电针预处理可通过对TLR4、NF-KB蛋白表达的调控，抑制TLR4/NF-KB及其介导的炎性级联反应，减轻炎性损伤[21]。

然而，这些研究目前仅处于基础研究水平，并不足以用于临床应用。因此，以TLR4 为靶点的药物的研制与开发仍是我们目前研究的重点。

3.3 肝脏缺血再灌注损伤 肝脏缺血再灌注损伤不仅是一个涉及肝脏自身的生理病理过程，也是一个复杂的系统过程，影响多个组织和器官。肝脏缺血再灌注损伤会严重损害肝功能，甚至造成不可逆转的损害，并引起多器官功能紊乱。

肝脏缺血再灌注损伤包括热缺血和冷保存两种类型，它们的病理改变及发病机制较为相似。肝脏缺血再灌注损伤的发病机制至今尚未完全阐明。目前已知，在肝脏缺血再灌注损伤过程中，涉及的因素包括无氧代谢、线粒体氧化过程异常、细胞内钙超载、肝枯否细胞和中性粒细胞、细胞因子和趋化因子的参与[22]。缺血再灌注损伤的发病机制是多种原因共同作用引起的，但所有的生理病理过程都有一个类似的信号通路——TLR 信号通路，尤其是TLR4，在缺血-再灌注损伤的炎症阶段具有基本的基础作用。

之前有研究结果表明，TLR4可通过激活NF-KB信号在肝脏缺血再灌注损伤的发病机制中发挥关键作用[23]，一些药物通过TLR4/NF-KB途径还可发挥抗炎和保肝作用[24]。而近期的研究揭示，TLR4-MyD88信号传导途径可能是通过IRF5调节因子在肝脏缺血再灌注损伤中发挥作用，同时认为，N-乙酰半胱氨酸可以抑制TLR4-IRF5信号通路并因此改善肝损伤[25]。Youn[23]通过将TLR4敲除小鼠与其野生型对应物进行对比，发现IRF3作为TLR4-TRIF信号传导途径的下游信号分子，介导了缺血再灌注损伤的发生。因此，TLR4信号通路的治疗干预可能成为肝切除、失血性休克和肝移植后临床环境中预防肝脏缺血再灌注损伤的有希望的靶标。

3.4 肺缺血再灌注损伤 临床上将肺缺血再灌注导致的肺损伤分为两种类型，一种是阻断血液灌注而通气仍维持时，称为通气性缺血；另一种是通气和血液灌注都被阻断时，称为缺氧性缺血。这两种类型都可引起血管阻力和通透性的升高，从而引起肺水肿和肺动脉高压。实验证明，肺缺血再灌注损伤的机理包括氧化应激、钙超载、细胞凋亡、促炎介质的释放、白细胞的激活、钠泵失活等[26]。

Zanotti等[27]人通过将TLR4缺陷小鼠与TLR4嵌合小鼠进行研究比较，发现TLR4不仅通过MAPK和NF-KB信号传导促进炎症反应，而且可介导肺缺血再灌注时的肺水肿。Merry等[28]研究表明，TLR4在肺缺血再灌注损伤的发展中起关键作用，且在肺泡巨噬细胞的活化中尤为重要。Prakash等[29]研究表明，肠道微生物菌群的减少可以明显降低体内由肺缺血再灌注引起的炎症反应，以及肺泡巨噬细胞对TLR4的反应能力。此外，这些数据表明通过减少肠道微生物菌群可以减弱肺缺血再灌注损伤。不仅如此，有研究还表明，TLR4可在LPS的激活下促进缺氧诱导因子-1α的表达，上调炎症因子水平，进而加重肺缺血再灌注后肺组织的炎症损伤程度[30]。这些研究都为通过减少TLR4的表达来降低缺血再灌注引起的损伤提供了理论基础，然而如何真正有效、安全的落实到临床应用上仍需我们进一步研究。

3.5 肠缺血再灌注损伤 与其他器官不同，肠道缺血再灌注损伤更为繁琐且严重，它不仅有氧化应激过程、炎症反应、细胞凋亡，还可因肠黏膜屏障的破坏导致细菌移位、休克、肺及肝脏等多器官衰竭，死亡率较高[31]。有研究表明，肠道黏膜上的TLR4能够识别并感知到大量微生物病原体的分子模式，从而介导炎症，并启动后续一连串的免疫反应。其中内源性配体和外源性配体激活的TLR4被认为是致病菌或创伤性炎症的主要因素之一，它会导致肠黏膜损伤和屏障破坏[32]。

LPS是TLR4的主要外源性配体，它通过调节TLR4信号传导进行低剂量预处理，可有效减少肠缺血再灌注损伤的炎症反应[32]。TlR4的内源性配体HMGB1则经过触发MyD88和TRIF依赖的下游信号通路，在小鼠肠道缺血再灌注损伤中发挥关键用途。经过实验研究发现，抗HMGB1、抗MyD88和抗TRIF抗体的应用，都可显著减少缺血再灌注引起的损伤[33]。因此，近几年以研发TLR4为靶点的减缓肠缺血再灌注损伤的药物为主题的报道层出不穷，如经过罗格列酮预处理后，可以抑制TLR-4/NF-KB信号通路，进而降低炎症反应，减轻肠缺血再灌注损伤[34]。

同时有研究发现，TLR4参与肠缺血再灌注引起的肺、肝脏、肾等一些远隔器官的损伤，并在其中起重要作用。然而其具体机理及临床应用价值仍未明确，需要我们进一步的研究。

4 总论

近年来， 随着人们对TLR4及缺血再灌注损伤研究的不断加深， 愈来愈多的证据表明，TLR4与缺血再灌注损伤有着密不可分的关系。通过对TLR4结构及信号转导通路的了解， 以及TLR4在各器官缺血再灌注损伤的应用进展进行总结，为我们展现了以TLR4为靶点预防各器官缺血再灌注损伤的可研究性。但是，这些研究还是局限在基础研究层面，真正能应用于临床的成果却很少。而且，由于TLR4参与缺血再灌注损伤的功能及机制还不完全清楚，以TLR4 为靶点的治疗是否会对正常免疫系统产生不良影响，需要进一步研究和确认。