从耐药机制分析ALK-TKI序贯治疗ALK重排非小细胞肺癌的理论基础

唐春兰 刘 芳 周向东

肺癌是全球最常见的恶性肿瘤，其病死率居恶性肿瘤的首位[1]。肺癌的85%为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)。随着分子医学的进展和靶向药物的不断涌现，NSCLC治疗已经进入了个体化治疗的时代。间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase, ALK)最初是在间变性大细胞淋巴瘤中的一种亚型中被发现，由此得名为。2007年Soda等[2]首次发现肺癌中存在着具有转化活性的EML4-ALK融合基因变异现象，转染该融合基因的裸鼠肿瘤生长迅速，生成很多肺腺癌结节，ALK抑制剂能显著降低瘤负荷，延长生存，从而鉴定出EML4-ALK是NSCLC的驱动基因。与天然的ALK定位在胞膜且一般为失活状态不同，EML4-ALK定位于胞质中，为结构性激活形式。主要通过三条信号转导通路：MAPK/MEK/ERK、PI3K/AKT和RAS/STAT3促进细胞的增殖和侵袭转移，抑制凋亡[3]。ALK重排的NSCLC是肺癌的一种亚型，患者多为不吸烟的肺腺癌，男女均有，平均年龄52岁，发病偏年轻。虽然ALK重排阳性的NSCLC仅占全部NSCLC的5%，但是预后较差，中位的生存期仅为6个月，2年的生存率仅为12%[4]，因此积极的治疗非常迫切。

克唑替尼(Crizotinib)是一种口服的ALK激酶抑制剂(ALK-TKI)，竞争性结合激酶区的ATP位点，阻止ALK激酶的活化。克唑替尼于2011年8月和2013年1月先后获得美国食品和药品管理局(FDA)和中国食品和药品管理局(CFDA)批准用于治疗进展期ALK基因重排的NSCLC。Profile 1014是首个克唑替尼对比培美曲塞含铂化疗一线治疗ALK重排NSCLC的随机对照的三期临床研究。与化疗比较，克唑替尼治疗后疾病缓解率高(74%vs. 45%，<0.001)，m-PFS延长(10.9 mvs. 7.0 m，HR 0.45，P<0.001)，疾病的复发风险下降, 中位总生存期还没有达到，但是已经看到延长的趋势(NRvs. 47.5，HR 0.76)[5-6]。Profile 1014研究的亚组分析也发现克唑替尼对脑转移患者具有较好的治疗效果，能有效延长颅内的疾病进展[7]。近几年第二代和第三代的ALK-TKI发展非常迅速，二代TKI包括塞瑞替尼(Ceritinib)、阿来替尼(Alectinib)和布加替尼(Brigatinib)，三代TKI以劳拉替尼(Lorlatinib)为代表。与克唑替尼相比，新一代的ALK-TKI不仅具有较好的血脑屏障的通透性，而且对突变的ALK激酶仍然具有抑制的活性。二代ALK-TKI不仅对克唑替尼治疗进展的ALK重排的NSCLC具有治疗效果，而且在一线治疗也显示了卓越的疗效，尤其是阿来替尼。ALEX研究发现阿来替尼一线治疗ALK重排NSCLC，m-PFS的获益明显优于克唑替尼(25.7 mvs. 10.4 m，HR 0.50，P<0.0001)，尤其是抑制颅内的疾病进展的效果显著，克唑替尼治疗1年的累积的颅内进展比率为41%，而阿来替尼治疗1年的累积的颅内进展比率仅为9.4%[8]。目前塞瑞替尼、阿来替尼和布加替尼在美国均获得了治疗克唑替尼治疗进展或不耐受的ALK重排NSCLC的适应证，三代TKI 劳拉替尼在美国获得了克唑替尼或至少一种其它ALK-TKI治疗进展的ALK重排NSCLC的适应证。此外塞瑞替尼和阿来替尼在中国也得到了获批。塞瑞替尼的适应证是克唑替尼治疗进展或不耐受ALK重排NSCLC，阿来替尼获得了一线治疗ALK重排NSCLC的适应证。多个临床研究都显示出克唑替尼序贯二代ALK -TKI治疗的中位中生存超过了4年。例如：Gainor等[9]报道了克唑替尼序贯塞瑞替尼中位OS达到49.5个月。Watanabe 等[10]分析克唑替尼序贯阿来替尼的中位OS达到51.5个月。Profile 1014研究报道克唑替尼序贯二代ALK-TKI治疗总生存超过了5年[11]。来自法国的真实世界研究报道克唑替尼序贯二代ALK-TKI的中位OS超过了7年，达到了89.6个月[11]。本文将通过克唑替尼和二代ALK-TKI的耐药机制来分析克唑替尼序贯二代TKI获得长期生存的理论基础。

一、克唑替尼和二代ALK-TKI的耐药机制不同

Galnor等[12]对83例ALK阳性NSCLC患者在克唑替尼和第二代ALK-TKI在发生获得性耐药时进行重复活检，获得103例组织标本，通过基因测序分析耐药机制。作者发现克唑替尼和二代TKI耐药后仍然存在ALK重排，但是它们的耐药机制有很大的差异。它们耐药后都出现了ALK的突变，但是突变的比例和突变的位点是不一样的。克唑替尼耐药的患者中，20%出现了ALK突变，主要的突变位点是L1196M(7%)和G1269A(2%)。塞瑞替尼、阿来替尼或布加替尼耐药的患者出现ALK突变的比例明显增加，分别是54%， 53%和71%，G1202R是最常见的耐药突变，分别为21%，29%和43%。除了G1202R，塞瑞替尼耐药突变还有F1174L/C(17%)和C1156Y(8%)，阿来替尼的耐药突变有I1171/N/S(12%)和V1180L(6%)，布加替尼的耐药突变还有E1210K(29%)、D1203N(14%)和S1206Y/C(14%)。此外，在5例二代TKI耐药的患者还同时出现2个和3个ALK突变位点。除ALK突变介导TKI耐药，Galnor等[12]发现有的患者在TKI耐药后并没有出现ALK突变。Costa等[13]从药代动力学和旁路激活进一步分析未突变的原因。克唑替尼最常见的耐药机制是药代动力学问题(65%)，而ALK突变比例仅为20%，还有15%为旁路激活。但是二代TKI(塞瑞替尼和阿来替尼)耐药的原因和克唑替尼有很大的区别，它们的耐药没有药代动力学问题，主要是ALK突变(55%)和旁路激活(45%)。分析以上数据，说明克唑替尼和二代TKI的耐药机制是不同的。克唑替尼的耐药机制主要是药代动力学的问题，其次为ALK突变和旁路激活；二代ALK-TKI的耐药机制主要是ALK突变和旁路激活。

二、从克服药代动力学的缺陷分析ALK-TKI序贯治疗的理论基础

药代动力学问题引起克唑替尼耐药最主要的原因是药物通过血脑屏障的能力较差。P糖蛋白(ABCB1/ABCG2)阻止克唑替尼在颅内蓄积[14]，克唑替尼脑脊液的药物浓度仅为血药浓度的0.26%[15]，这导致克唑替尼耐药最常见的是颅内进展，而颅外的病灶可能仍然获益。法国真实世界研究发现在263例克唑替尼治疗进展的患者中，寡进展的比例高达73%，其中最常见的是颅内进展，比率达到44%[11]。克唑替尼的Profile 1005和Profile 1007两个临床研究中194例治疗进展的患者中最常见的颅内进展，比率为41%[16]。有几例个案报道了增加克唑替尼的剂量可以改善原剂量治疗时出现的颅内进展[17-19]，其中Wang等[19]报道了克唑替尼250 mg, bid的原剂量治疗时出现颅内进展的一例ALK重排NSCLC患者，在联合颅内放疗失败后采用了克唑替尼500 mg，bid，用一天停一天的脉冲式给药方式，患者的颅内疾病得到了有效控制，检测药物浓度发现克唑替尼增量后脑脊液浓度有所提高。但是要注意克唑替尼增量时带来不良反应的增加风险。此外，疾病进展后继续克唑替尼治疗(Continuing crizotinib beyond disease progress, CBPD)联合局部治疗也能进一步改善颅内的病变。PROFILE 1005和1007研究中194例患者克唑替尼耐药患者，经过医生的评估，120例患者继续使用克唑替尼治疗，其中51%为颅内进展。CBPD的患者获得了29.6个月的中位OS，而直接停药患者的中位OS仅为10.8个月，多因素分析CBPD与总生存有相关性[16]。Profile 1014研究克唑替尼一线治疗疾病进展的患者中，CBPD比例为83%，最多可以获得长达34.3个月治疗持续时间[5-6]。Costa分析了克唑替尼治疗的26例ALK重排NSCLC的5y-PFS，有15位患者CBPD或联合放疗，10位患者序贯二代ALK-TKI。虽然初次进展的中位PFS仅为9个月，但是5年的PFS率为9%，中位OS超过了48个月[20]。法国真实世界研究中86例CBPD的患者，获得了32.3个月的中位OS，停药组的中位OS仅为11.2个月[11]。除了CBPD联合局部治疗，二代TKI因为其很好的血脑屏障通透能力，对于克唑替尼治疗耐药的颅内进展的患者仍然有效。ASCEND-2研究报道了20例克唑替尼治疗进展的ALK阳性脑转移的患者经过塞瑞替尼治疗，9例患者颅内病灶明显缩小，颅内的疾病缓解率为45%[21]。NP28673研究报道了35例克唑替尼治疗进展的ALK阳性脑转移患者经过阿来替尼治疗，20例患者颅内病灶显著缩小，颅内疾病缓解率为57%，其中7例患者病灶消失，完全缓解率达到20%[22]。Camidge等[23]也报道了布加替尼(90 mg/d连续使用7 d再增量到180 mg/d)对克唑替尼治疗进展的脑转移患者的颅内缓解率达到67%，颅内的m-PFS为18.7个月。Johung等[24]报道90例ALK重排NSCLC脑转移患者的疗效，通过克唑替尼和二代TKI以及放疗的综合使用，中位OS长达49.5个月。分析以上数据提示血脑屏障通透性差是克唑替尼治疗出现颅内进展的主要原因。克唑替尼治疗后的颅内进展除了可以通过药物增量或者CBPD联合局部治疗最大化地发挥克唑替尼的作用，更重要的是序贯二代TKI治疗，充分利用二代TKI血脑屏障通透性好的优势，给患者带来进一步的获益。最新的国际指南也指出在克唑替尼治疗过程中发生症状性脑转移时，基于ALEX研究中阿来替尼的中枢控制优势，建议直接转换为二代阿来替尼。

三、从克服ALK突变的耐药机制分析ALK-TKI序贯治疗的理论基础

克唑替尼耐药最常见的突变位点是L1196M和G1269A。基础研究发现二代TKI对这些突变的ALK激酶是敏感的。临床研究显示塞瑞替尼、阿来替尼和布加替尼对克唑替尼耐药的患者仍然有效。ASCEND-2研究报道了140例克唑替尼治疗进展的患者经过塞瑞替尼治疗，疾病缓解率为38%，m-PFS为7.2个月[21]。NP28673研究报道了122例克唑替尼治疗后疾病进展的患者经过阿来替尼治疗，61例患者获得部分反应，疾病缓解率达到49%，m-PFS为8.9个月[22]。ALTA研究110例克唑治疗进展的患者经过布加替尼治疗，疾病缓解率达到55%，颅内的m-PFS为15.6个月[23]。二代ALK-TKI耐药后会产生新的突变位点。ALK G1202R突变是塞瑞替尼，阿来替尼和布加替尼共同的耐药位点，只有三代TKI 劳拉替尼对它是敏感的，这提示二代TKI治疗耐药后伴随G1202R突变，可以选择劳拉替尼治疗。临床研究显示劳拉替尼对二代TKI治疗进展的患者，有效率仍然达到39%，颅内的缓解率为48%[25]。此外，二代ALK-TKI耐药后也可以根据相应的ALK突变位点，考虑换用其他的二代药物。例如阿来替尼耐药后出现的ALK I1171/N/S和V1180L，塞瑞替尼是敏感的。临床研究显示，塞瑞替尼对阿来替尼耐药患者的治疗缓解率为25%，m-PFS为3.7个月[26]。通过分析ALK突变的耐药机制说明克唑替尼序贯二代TKI的合理性，即使二代TKI耐药后并伴有ALK突变，仍然可以序贯三代TKI或者其他的二代TKI。即使三代ALK-TKI 劳拉替尼治疗进展后，如果耐药的机制是因为ALK激酶区的L1198F突变，还可以再次使用克唑替尼治疗。有个案报道1例患者在劳拉替尼治疗后出现疾病进展，经过重复活检和测序发现ALK L1198F突变，转化研究发现该突变引起ALK激酶区的结构改变，劳拉替尼无法结合在ATP位点，而克唑替尼可以结合。因此再次使用克唑替尼治疗，为患者带来了进一步的获益[27]。

四、旁路激活的耐药机制和治疗策略

旁路激活是克唑替尼和二代TKI共同的耐药机制[13]。目前旁路激活的研究主要在细胞和动物水平，缺乏临床研究。克服旁路激活的治疗策略主要是ALK-TKI和旁路信号分子抑制剂的联用模式。旁路激活可能和EGFR，KRAS，MET，KIT和IGF-1R等激酶活化有关，上述激酶活化激活下游PI3K，MAPK和STAT3等信号通路[13,28]。Yamaguchi和Tani等[29-30]分别报道了利用克唑替尼或阿来替尼持续作用于ALK重排的肺癌细胞，诱导产生耐药。发现耐药细胞的EGFR磷酸化水平提高，EGFR下游的信号通路活化。ALK-TKI联合EGFR-TKI(厄洛替尼或者阿法替尼)可以有效改善耐药。Lovly等[31]在ALK-TKI耐药的ALK重排的肺癌细胞中发现IGF-1R及下游信号通路活化，当敲除IGF-1R基因，耐药细胞对ALK-TKI的敏感性提高。Li等[32]发现克唑替尼联合二甲双胍可以改善由IGF-1R信号通路介导的耐药。Cuyàs等[33]在克唑替尼耐药细胞中发现下游信号蛋白STAT3持续活化，克唑替尼联合水飞蓟宾能抑制STAT3磷酸化，提高耐药细胞对克唑替尼的敏感性。Galnor等[12]发现ALK-TKI耐药的肿瘤还出现了基质上皮样转化(EMT)，即耐药细胞呈现恶性梭形细胞样改变，缺乏上皮样细胞的形态特征和标志物。林采余等[34]发现水飞蓟宾可能通过逆转EMT，增加克唑替尼的敏感性。此外，ALK扩增也参与了TKI的耐药[12]，在36例克唑替尼治疗进展的患者中，有3例患者(8.3%)出现ALK基因的扩增，但没有ALK的突变。ALK扩增引起耐药的具体原因还不清楚。总的来说，旁路激活非常复杂，在二代TKI的耐药机制中的比例高达45%，需要引起重视。体外研究发现劳拉替尼对旁路激活的耐药细胞敏感性较差[12]，临床研究也发现了二代TKI耐药但是没有ALK突变的患者，劳拉替尼治疗的缓解率仅为26%，大大低于ALK突变患者76%的缓解率[25]。

虽然从耐药机制上初步分析了克唑替尼序贯二代TKI治疗的理论基础，但是还有一些问题值得思考和深入研究。首先，为明确旁路激活引发耐药的治疗策略，开展临床研究迫在眉睫。ALK-TKI联合旁路信号分子抑制剂的治疗效果也需要临床研究来证实，同时要考虑对药物剂量和不良反应的管理。其次，重复活检的观念和活检技术需要提高，尤其在二代ALK-TKI耐药后重复活检显得更为重要。还有，脑转移的分子耐药机制还不太明确。目前研究中的重复活检的标本主要来自于颅外，不能完全反映颅内的耐药机制。可以考虑通过手术切除脑转移病灶或抽取脑脊液进行检测分析。最后，克唑替尼通过肝药酶的代谢生成活性产物，克唑替尼耐药后出现的肝转移是否有药代动力学的问题也值得深入研究。

克唑替尼和二代ALK-TKI的耐药机制是不同的。克唑替尼耐药机制主要是药代动力学问题，其次为ALK突变和旁路激活；二代TKI耐药机制主要是ALK突变和旁路激活。脑转移是克唑替尼治疗最常见的疾病进展模式，通过继续使用克唑替尼或者联合局部治疗能够再次获益，最大化的发挥克唑替尼的疗效。无论是克唑替尼药代动力学问题还是ALK激酶突变引发的克唑替尼耐药，二代TKI都能很好的克服。真实世界的研究发现阿来替尼治疗克唑替尼耐药的ALK阳性NSCLC亚洲的患者，其有效率高达89%[35]。二代TKI耐药后容易出现ALK的G1202R突变，这是三代劳拉替尼敏感的靶点。因此克唑替尼序贯二代TKI的治疗模式充分发挥了各个TKI的优势，为ALK重排NSCLC患者长期生存获益奠定了理论基础。值得注意的是：①基于ALEX研究阿来替尼对比克唑替尼的PFS及颅内进展控制优势，NCCN指南已将阿来替尼作为ALK重排NSCLC一线治疗优选推荐，但目前OS数据并未成熟，OS是否能超越克唑替尼序贯治疗还未可知。现在克唑替尼和塞瑞替尼均进入国家医保报销，减轻了患者的经济负担，提高了治疗药物的普及性，为ALK-TKI序贯治疗提供了切实的保障，因此ALK-TKI序贯治疗仍然是目前优选治疗方案之一；②对于ALK-TKI治疗出现疾病进展时，首先需要明确其耐药机制，二次/重复活检后基因检测尤其重要，根据耐药机制选择后续治疗可使患者更多获益。