骨肉瘤免疫治疗的现状与展望

朱超, 张英泽

骨肉瘤是骨最常见的原发性恶性肿瘤,起源于间质干细胞[1]。骨肉瘤最常见的转移部位是肺(超过85%)和骨骼。在没有引入化疗之前,骨肉瘤的预后很差,骨肉瘤患者的生存率低于20%[2]。目前对于新诊断的骨肉瘤的治疗包括术前化疗、手术和术后化疗。通过实施足够切除范围的手术结合使用甲氨喋呤、阿霉素、顺铂及环磷酰胺的新辅助化疗,已经将骨肉瘤的生存率提高至60%～70%[3]。另一方面,复发、转移以及不能完整手术切除的骨肉瘤患者对于化疗存在有耐药性,近30年来治疗效果一直未有明显改善,生存率仍低于20%[4]。2013年,Science杂志把肿瘤免疫治疗列为2013年十大科技突破之首[5]。2018年诺贝尔生理学或医学奖授予在肿瘤免疫治疗方面做出突出贡献的两位科学家。近年来,很多学者和机构致力于免疫疗法对骨肉瘤的研究,取得了重大突破。本文就免疫治疗应用于骨肉瘤的作用机制和现状进行阐述。

1 骨肉瘤的主动免疫治疗

主动免疫是通过向体内输入生物制剂或细胞因子激活宿主免疫系统对抗肿瘤的一种治疗方式。可分为非特异性主动免疫治疗和特异性主动免疫治疗。

1.1 骨肉瘤的非特异性主动免疫治疗

非特异性主动免疫是指应用非特异性免疫制剂(细胞因子及其诱导剂)激活或增强宿主免疫系统功能,直接或间接杀伤肿瘤细胞。目前用于骨肉瘤主动免疫治疗的细胞因子主要有干扰素 (IFN)和IL-2。IFN-α具有诱导分化和凋亡以及抑制肿瘤细胞增殖和血管生存的作用[6]。早在19世纪70年代,就有在体外实验中IFN-α抑制骨肉瘤细胞生长的报道[7]。2015年Bielack等[8]报道了一项聚乙二醇化的IFN-α-2b在骨肉瘤患者中作用的随机对照研究结果,在该研究中患者单独使用MAP方案(甲氨喋呤、阿霉素、顺铂)或MAP联用IFN-α-2b方案。MAP方案组及MAP联合IFN-α-2b组5年生存率分别为81%及84%,数据显示辅助性使用IFN-α-2b的疗效甚微。但课题组仍在进行随访以确定两组患者长期生存率的差异。IL-2具有促进淋巴细胞的增殖分化及诱导淋巴因子激活杀伤细胞(lymphokine activated killer cell, LAK)的作用,而LAK可以识别和杀灭肿瘤细胞[9]。Meazza等[10]报道了在转移性骨肉瘤患者中除常规手术治疗及化疗外,使用IL-2或联用LAK治疗,3年无症状生存率及总生存率分别为34%和45%。在一项使用大剂量的IL-2治疗复发的儿童肉瘤研究中,4例骨肉瘤患儿有2例对治疗有完全反应,但是同时观察到有白细胞、肌酐、C-反应蛋白、血糖升高和红细胞、血小板、白蛋白降低等严重不良反应[11]。综合以往临床研究,我们发现细胞因子虽然可以激活抗肿瘤免疫反应,但对于骨肉瘤患者的治疗,效果并不明显。

1.2 骨肉瘤的特异性主动免疫治疗

特异性主动免疫治疗是指利用肿瘤细胞或肿瘤抗原物质输入体内诱导机体产生特异性细胞免疫和体液免疫效应,阻止肿瘤的生长扩散和复发。应用在骨肉瘤治疗的特异性主动免疫治疗有肿瘤疫苗。

1.2.1 靶向非特异性抗原肿瘤疫苗(vaccination targeting non-specific antigen) 骨肉瘤的抗原非特异性疫苗主要来源于自体肿瘤细胞。1972年Marcove等[12]首次报道了使用灭活的自体瘤苗治疗骨肉瘤,在没有使用辅助化疗情况下21例患者中9例生存期超过5年。但由于新辅助化疗的引入,这些成果当时并没有引起足够的重视。树突状细胞(dendritic cells, DC)作为体内功能最强的抗原递呈细胞,具有激活T细胞的功能及促进细胞毒性T细胞(cytotoxic T lymphocytes, CTL)增殖的作用。一项使用负载自体肿瘤细胞裂解物的DC疫苗治疗骨与软组织肉瘤的临床1/2期试验中,评估了35例患者的临床反应,28例患者显示肿瘤进展,6例患者病情稳定,1例患者在疫苗注射后8周显示部分反应。患者的3年生存率和无疾病进展生存率分别为42.3%和2.9%[13]。Himoudi等[14]报道了12例复发的骨肉瘤患者接种了负载自体肿瘤细胞裂解物的DC疫苗,结果证实这种治疗是安全可行的,但仅有2例患者被诱导出了明显的抗肿瘤反应。使用抗原非特异性肿瘤疫苗的优点有它可以促使患者的免疫系统选择最具有免疫原性的抗原以及没有HLA配型限制。另一方面,由于在不同肿瘤和患者之间,肿瘤细胞中的抗原组成变化很大以及在肿瘤发生发展过程中,各种天然抗原经过免疫编辑后可能无法被自体免疫系统所识别都会导致疫苗的有效性不高。为了改善骨肉瘤的肿瘤疫苗治疗效果,仍需要进一步研究肿瘤相关抗原(tumor-associated antigens, TAAs)和肿瘤特异性抗原(tumor-specific antigens, TSAs)作为治疗靶点。

1.2.2 靶向特异性抗原肿瘤疫苗 为了提高肿瘤疫苗的有效性,人们开始研究鉴定肿瘤特异性抗原。癌症-睾丸抗原家族(CTAs)是肿瘤免疫治疗的一种良好候选靶标。Krishnadas等[15]报道利用DC负载瘤苗靶向CTAs抗原MAGE-A1, MAGE-A3 和NY-ESO-1联合吉西他滨治疗复发的神经母细胞瘤、尤文肉瘤、骨肉瘤和横纹肌肉瘤,10例患者中1例完全缓解,1例获得长期无病生存;同时,检测了9例患者的T细胞数量变化情况,6例患者T细胞值有所上升,并且临床症状的缓解和T细胞值的升高有相关性。

1.2.3 个体化肿瘤疫苗 2017年,同一期Nature杂志上分别报道了德国和美国2个团队针对黑素瘤的“个体化疫苗”治疗临床实验[16-17]。两组团队制备的疫苗类型及方法不同,但均是根据每例患者独特的基因突变模式而制备个体化疫苗。两组实验结果均显示了良好的安全性和治疗效果,并且都在联合使用免疫检查点抑制剂(抗PD-1抗体)后进一步提高了疗效。尽管两项实验只涉及黑色素瘤的治疗,但在他们的研究中对肿瘤新生抗原的高效预测方法无疑会给骨肉瘤疫苗的发展带来巨大的变革,给人们研发高效的骨肉瘤疫苗带来启发。

2 骨肉瘤被动免疫治疗

被动免疫治疗又称过继性免疫治疗(adoptive immunotherapy, AIT),是指将经体外扩增、活化的自体或同种异体免疫活性细胞输给免疫功能低下的机体,增强其免疫应答,发挥直接或间接杀伤肿瘤细胞的治疗方法。免疫活性细胞包括LAK、肿瘤浸润的淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocytes, TILs)、细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer, CIK)、 细胞毒性T细胞(cytotoxic T lymphocytes,CTLs)、DC和自然杀伤细胞(NK)。

2.1 TILs

在肿瘤复杂的微环境中,TILs对肿瘤的生长起着至关重要的调节作用。TILs的一个关键特征是它们能够迁移和浸润肿瘤,而其他T细胞由于趋化因子受体的缺失而无法迁徙到肿瘤部位[18]。当遇到肿瘤抗原时,TILs可以直接杀灭肿瘤细胞并释放能够介导抗肿瘤免疫反应的细胞因子如IFN-γ, IL-2和TNF[19]。利用TILs作为效应细胞的过继性免疫治疗是已知最早使用T细胞有效治疗实体瘤的过继性免疫治疗形式[20]。这些表明TILs有可能成为治疗骨肉瘤的潜在有效手段。然而由于依靠当前的技术水平从骨肉瘤组织中分离和扩增TILs非常困难,至今尚没有使用TILs作为效应细胞的过继性免疫治疗用于骨肉瘤患者的临床试验报告。Cohen等[21]在2015年首次成功的在实施免疫治疗前患者的TILs和外周血中分离出突变反应T细胞,这将有利于为晚期肿瘤患者设计个性化的免疫治疗方案。

2.2 基因工程肿瘤特异性T细胞 (gene-engineered tumor-specific T cells)

基因转移技术的发展使T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)的基因转导成为可能,这可以赋予T细胞新的抗肿瘤特异性,可分为TCR、嵌合型T细胞(TCR-T)和嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)。

2.2.1 TCR-T治疗 将编码TCRα和β链的基因导入T细胞,能够产生特异性识别TAA和TSA的T细胞[22]。 现已克隆出多种HLA-A2限制性TCR,能够识别癌症-睾丸抗原家族MART-1, gp100, MAGE-A3及NY-ESO-1等多种抗原。Robbins等[23]报道了18例NY-ESO-1阳性滑膜肉瘤患者中,11例(61%)接受了经NY-ESO-1反应性TCR转导的自体T细胞,显示出一定的临床疗效,其5年生存率为14%。

2.2.2 CAR-T治疗 CAR-T细胞治疗是利用嵌合抗原受体设计的T淋巴细胞进行过继免疫治疗。CAR-T细胞可以通过组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC) 非依赖性的方式识别肿瘤抗原。但CAR-T细胞治疗经常会带来严重的副作用,主要是细胞因子释放综合征和脱靶效应[25-26]。细胞因子释放综合征是由于激活的淋巴细胞在清除肿瘤细胞时的强烈反应所引起。患者体内C-反应蛋白、IL-6和IFN等水平过高,患者有低血压,高热和神经系统的症状。脱靶效应是由于当肿瘤组织和正常组织都存在目标靶点时,即使正常细胞表达的靶点抗原处于很低的水平同样可以清除正常细胞。一项使用靶向HER2的CAR-T细胞治疗复发/难治性肉瘤患者的1/2期临床试验显示,17名患者中有4人的病情稳定,并且未表现出明显的毒副作用[24]。虽然需要进一步研究高度特异性的TSAs,但靶向这些抗原的TCR-T和CAR-T过继性细胞治疗仍然为骨肉瘤患者提供了一种新的、有前景的治疗方案。

2.3 CTLs

CTLs主要是CD8+T细胞,它可以在MHC限制的条件下,特异性杀伤肿瘤细胞,在抗肿瘤中发挥重要作用。CTLs能够杀伤表达特异性抗原肽-MHC-I类分子复合物的靶细胞,对其他细胞无损伤作用,所以寻找能够被CTL靶向的TSAs是骨肉瘤过继免疫治疗的重要环节。癌症/睾丸抗原家族(CTAs)是CD8+T细胞识别的最佳TSAs之一,其中MAGE-A家族蛋白、NY-ESO-1均在骨肉瘤组织内表达[27]。但也一些CTA基因在骨肉瘤组织中被沉默化,给基于CTLs的免疫治疗带来困难。Li等[28]发现通过使用地西他滨对骨肉瘤细胞系U2OS和HOS进行去甲基化处理后,肿瘤细胞内表达的MAGE-A家族蛋白和NY-ESO-1有所增加,把在体外生成的特异性靶向CTAs的CD8+T细胞注入骨肉瘤的动物模型后可以观察到肿瘤体积的明显缩小。到目前为止,使用CTLs进行过继性免疫治疗骨肉瘤仍仅停留在临床前的动物实验阶段,效应细胞制备工艺的复杂及治疗过程中的淋巴细胞耗竭均影响了它的临床应用[29]。

2.4 γδT细胞

γδT细胞是机体固有免疫的重要组成部分,主要识别未被处理的多肽抗原,以前多认为它在皮肤黏膜及肝脏等部位的抗感染免疫中发挥重要作用。Kato等[30]首先发现它能够直接识别和杀灭骨肉瘤细胞。不同于αβT细胞,γδT可通过MHC非依赖性的方式不需要经过抗原递呈过程直接识别肿瘤抗原。有研究表明使用唑来磷酸或IFN-γ联合应用γδT细胞提高对骨肉瘤细胞的杀灭作用[31-32]。使用γδT细胞治疗血液系统肿瘤和实体瘤(肾癌、乳腺癌、前列腺癌)的临床试验已经开展,并显示出了良好效果[33]。目前使用γδT细胞治疗骨肉瘤的研究还停留在细胞学实验阶段,但体外扩增γδT细胞技术的进步无疑为将来的临床实验打下坚实的基础[34]。

3 免疫检查点阻滞治疗

免疫检查点与肿瘤免疫系统的关系是近来研究的热点。免疫检查点对于维持自我耐受和限制免疫反应以预防自身免疫性疾病是非常有必要的,但另一方面也会导致肿瘤的“免疫逃逸”。CTLA-4和程序性死亡受体-1(programmed death receptor-1, PD-1) 是表达于T细胞上的主要抑制受体,被认为是肿瘤细胞免疫抑制的重要组成部分,这些分子被认为是各类晚期恶性肿瘤新的治疗靶点[35]。PD-L1是PD-1的配体,在包括巨噬细胞和肿瘤细胞在内的多种细胞中均有表达,肿瘤组织介导了PD-1和PD-L1之间的相互作用。PD-1和PD-L1在骨肉瘤细胞中的表达被认为与预后负相关,在出现转移的骨肉瘤细胞中表达量明显高于未转移的骨肉瘤细胞[36]。Shen等[37]报道了PD-L1低表达病例的平均生存期是89个月,而高表达病例的平均生存期是28个月。综合对于骨肉瘤患者免疫检查点的研究,PD-1、PD-L1和CTLA-4均影响了肿瘤的发展,而免疫检查点是包括骨肉瘤在内的多种恶性肿瘤免疫治疗的理想靶点。Lussier等[38]报道使用抗PD-L1的抗体10F.9G2治疗骨肉瘤细胞接种的小鼠,结果发现肿瘤负荷减轻,模型动物生存期延长。一项将PD-1的单克隆抗体pembrolizumab应于治疗骨与软组织肉瘤的多中心、临床2期试验研究报告了在22例骨肉瘤患者中,1例出现部分反应,6例病情稳定,其余15例患者则出现了病情发展[39]。

4 多种免疫治疗方法的联合应用

免疫系统的复杂性以及单一方法的免疫治疗的欠佳效果提示我们联合应用多种免疫治疗可能是优化骨肉瘤治疗的策略。联合治疗方案应该通过免疫疗法的独特机制来设计。如CTLA-4和PD-1虽然均属免疫检查点,但CTLA-4是在免疫致敏阶段发挥作用,调控免疫应答强度;而PD-1主要是调控CTL的增殖,在免疫效应阶段发挥作用[40]。联合应用抗CTLA-4抗体和抗PD-1抗体在治疗黑色素瘤的临床实验中已经取得良好效果[41]。应用这两类抗体治疗转移性骨肉瘤小鼠模型,在一半的小鼠模型中肿瘤扩散得到完全控制[42]。Tang等[43]证实肿瘤组织中足够的T细胞浸润是对PD-L1阻断发生反应的先决条件,因而联合应用TILs和抗PD-L1抗体有良好的前景[44-45]。Kawano等[46]报道了联合应用DC负载自体肿瘤抗原疫苗和抗CTLA-4抗体治疗鼠骨肉瘤动物模型,联合治疗能够增强单一治疗的抗肿瘤效果。

5 免疫治疗与放化疗的联合应用

一些化疗药物如铂类、环磷酰胺诱导免疫原性细胞的死亡的能力使凋亡的肿瘤细胞成为“内源性疫苗”,这些化疗药物能通过多种机制激活机体的固有和适应性免疫系统,增强肿瘤细胞对免疫治疗的敏感性[47]。此外,化疗药物能够直接影响肿瘤的微环境,例如低剂量环磷酰胺和吉西他滨会耗尽调节性T细胞和骨髓抑制细胞从而促进效应物对肿瘤细胞的攻击[48]。和化疗类似,放疗也可以诱导免疫微环境的改变,包括诱导新抗原表达、释放能够招募免疫细胞的促炎细胞因子、促进抗原交叉表达等[49]。现已经在开展联合应用免疫检查点阻滞治疗和化疗或放疗治疗软组织肉瘤的临床试验(国际临床试验注册号:NCT03085225、NCT03307616)。相信相关的研究成果也会给骨肉瘤的免疫治疗和放化疗的联合应用带来启发。

6 结语

近年来,随着对肿瘤微环境、肿瘤侵袭转移机制、抗肿瘤免疫系统等方面研究的深入,以及体外提取扩增免疫细胞工艺的进步、过继性免疫治疗中先进的基因工程技术的发展、新的肿瘤特异性抗原的开发以及对免疫检查点研究的深入,免疫治疗有望成为骨肉瘤尤其是难治性、复发性骨肉瘤的主要治疗手段之一。类似于传统的化疗,可能需要联合应用多种免疫治疗方法来实现对肿瘤细胞有效并持久的免疫反应。更进一步的联合治疗策略则是确定免疫治疗与外科手术,放化疗的最佳组合。