IVC笼盒原位实施小鼠二氧化碳安乐死方法的建立*

庞 帅 师晓萌 鹿双双 吴 健 史光华 刘晓宇 卢选成

(1.中国疾病预防控制中心，北京 102206)(2. 中国合格评定国家认可中心，北京 100062)

随着社会发展和科技进步，积极践行“3Rs”原则、提高实验动物福利已成为科研人员不可推卸的责任[1]。安死术是指以迅速造成动物意识丧失而致身体、心理痛苦最小之处死动物的方法，具体方法依据动物品种和实验类型而确定[2]。安死术是实验动物福利的重要内容之一。对于大鼠、小鼠、豚鼠及仓鼠等实验动物，符合要求的CO2吸入法是一种可接受的安乐死方法[3-5]。

执行CO2安乐死，需严格控制气体置换率，美国兽医协会(American Veterinary Medical Association，AVMA)动物安乐死指南要求CO2气体置换率为10%～30%容器体积/min，英国动物法案要求为20%容器体积/min[3,5]。目前国内使用的CO2安乐死设备或自制仪器，往往无法按照国际要求精确控制进气量，且需将不同笼饲养的待处理动物转移到安乐死盒中。由此产生的问题是：(1)如果无法控制置换率，会在动物丧失意识前给动物造成痛苦。(2)动物在转移过程中及转移后处于陌生环境会产生应激反应；且实际工作中往往会转移过多动物到安乐死盒中，造成拥挤状态，这些都会增加动物痛苦。

市售二氧化碳安乐死设备一般可将CO2废气排到室外，而自制仪器往往将CO2直接排到室内。尽管CO2无味、不易燃、不易爆，但封闭环境内CO2相对浓度过高也会对操作人员健康造成危害。用于感染性实验的动物安乐死，其排出废气可能含有感染性物质而不能直接排入环境，该问题就更难以处理。作者就所在设施的软硬件条件下，希望在生物安全柜内，建立小鼠在原饲养独立通气笼(individually ventilated cage,IVC)盒中实施CO2安死术的方法，以解决上述问题，为同行提供一种可借鉴的方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1设备:Ⅱ级A2型生物安全柜(美国NUAIRE,NU-425-400E)，二氧化碳钢瓶(北京天海,40 L)，气体流量表(华清仪器仪表,25 L)，IVC笼盒(意大利泰尼百斯，1284 L)，胶管，进接口，密封胶带。使用手机(华为,P9)拍摄安乐死过程。

1.1.2实验动物

4～5周龄BALB/c小鼠，4～5周龄C57BL/6小鼠，2周龄C57BL/6小鼠，各10只，雌、雄各5只，均购自华阜康生物科技股份有限公司[SCXK(京)2014-0004]。

1.2 方法

1.2.1计算IVC体积: 泰尼百斯1 284 L笼盒近似梯形，按照以下公式计算泰尼百斯1 284 L小鼠笼盒体积。

S1为底面积，S2为顶面积，H为高度

1.2.2设备连接:将饲养有小鼠的IVC笼盒平稳移至生物安全柜中，将二氧化碳钢瓶出气管连接在IVC笼盒的进气接口。设锁扣保证接头连接紧密无气体泄漏，在输气胶管末端胶带密封避免气体泄漏，保证CO2以准确的流速通入笼盒。饲养笼的生命窗作为气体排出通道。(见图1)

图1 设备连接图Fig.1 Connection of the devices

1.2.3实施二氧化碳吸入法安乐死，观察动物:将CO2流量表调至符合10%～30%容器体积/min的流量，通CO2气体。通气过程中观察小鼠并录像。有研究指出，在一定浓度的CO2中动物可能因窒息而产生假死现象[6]，故待笼内所有动物均未观察到呼吸后，再保持通气1～2 min。取出小鼠,进一步观察呼吸、角膜反射、尸体僵硬以确认动物是否死亡。上述指标除尸体僵硬外，不能基于某个单独指标确认动物的死亡[6]。如有未死亡动物，在CO2麻醉状态下采用颈椎脱臼方法安乐死。按相关规定处理动物尸体。

通过录像观察小鼠，观察指标包括呼吸困难、躁动、爬高、停止有意识运动和停止呼吸(见表1)，记录每只小鼠停止有意识运动和呼吸的时间[7-9]。比较不同品系之间、不同周龄之间小鼠失去意识时间和死亡时间。

表1 CO2安死术观察指标Table 1 Observation index and standard of carbon dioxide euthanasia

1.2.4美国国立卫生研究院(National Institutes of Health,NIH)《成年啮齿类动物二氧化碳安乐死指南》(简称《指南》)对成年啮齿类动物使用二氧化碳安乐死方法提出了具体要求，将本方法与该指南要求做一比对，了解本方法是否符合其要求。

1.3 统计方法

采用两组间t检验方法分析观察结果。

2 结果

2.1 按照公式计算，泰尼百斯1 284 L笼盒体积约为9升

依据AVMA动物安乐死指南中的气体置换率为10%～30%容器体积/min的要求，本方法采用的CO2流速在0.9 L/min至2.7 L/min之间均可。本次研究置换率采用2.5 L/min(置换率为28%容器体积/min)，即将流量计刻度调至“2.5”。

图2 气体流量表刻度Fig.2 The scale of flowmeter

2.2 不同品系和不同周龄小鼠之间比较

按照方法中提到的连接方式连接设备，气体流速2.5 L/min，对4～5周龄Balb/c小鼠和C57BL/6小鼠，2周龄C57BL/6小鼠进行二氧化碳安乐死。安乐死过程中,观察到小鼠躁动、爬高、停止有意识运动和呼吸停止等一系列行为变化。结果见表2，4～5周Balb/c小鼠和C57BL/6小鼠约在2～3 min之间失去意识，4～5分钟之间停止呼吸。2周龄C57BL/6小鼠停止呼吸所需时间较长，与4～5周龄C57BL/6小鼠相比停止呼吸的时间差异有统计学意义。

表2 各组小鼠丧失意识和停止呼吸时间的比较Table 2 Comparison the time of losing conscious and death between different groups

注：与4～5周龄C57BL/6组比较，*P<0.05

Note：*P<0.05,compared with 4～5 w C57BL/6 group

2.3 该方法与NIH的要求相比较结果

NIH《指南》对成年啮齿类动物使用二氧化碳安乐死方法提出以下要求[4]，本文建立的方法符合其要求(见表3)。

表3 本方法与NIH《指南》要求的比较Table 3 Comparison of this method with the requirement of NIH Guidelines

3 讨论

通过与NIH《指南》要求相比，本研究成功建立了一种小鼠在原饲养IVC笼盒中实施二氧化碳安乐死的方法。Balb/c小鼠和C57BL/6小鼠失去意识和死亡所需时间无统计学差异,均适用于该种方法；不同性别小鼠失去意识和死亡所需时间也无统计学差异。《指南》推荐超过10日龄小鼠可使用二氧化碳安乐死，本研究将2周龄与4～5周龄C57BL/6小鼠相比较，失去意识的时间无显著区别，但死亡时间有统计学差异。可能与周龄较小的鼠对氧气量的需求相对较低，故所需时间更长有关。

该方法优点在于：首先，CO2气体对操作人员身体健康危害较小，并且相对于颈椎脱臼、放血、断头等物理方法，该方法对操作人员的心理冲击也较小；其次，在动物原饲养笼具中实施二氧化碳安死术，能有效地避免待处理动物在转移到新环境后产生应激反应，降低动物安乐死过程中的可能存在的疼痛和焦虑，提高了动物的福利。IVC笼遮光性好但又不影响透过笼盒观察动物安乐死过程中的行为变化；最后，该方法操作简单，提高了工作效率。

从生物安全角度考虑，IVC笼具密封性好，充入CO2气体不会外溢。CO2气体密度大于空气，位于空气下部，而笼盖顶部的生命窗可作为出气通道使原有空气排除。本研究中，安乐死操作在生物安全柜内进行。我们使用烟雾发生器检测了通入CO2过程中笼盒生命窗处的气体流向，气体均通过位于工作台面前面和后面的排风格栅排出，符合Ⅱ级A2型生物安全柜要求。这有效解决了感染性动物安乐死的生物风险问题，保证病原微生物通过生物安全柜的高效过滤器排出而不会泄露到环境中。

然而随着研究的深入开展，安乐死方法也将不断改进。CO2安乐死存在的不足之处是：一是动物对CO2气体有厌恶感；二是动物吸入CO2气体过程中，CO2会在呼吸系统和视觉系统的黏膜处形成碳酸而引发疼痛，也会因缺氧而造成呼吸困难[10]。疼痛感受器在CO2浓度达到40%时开始应答，故为使动物在感受到疼痛前失去意识，AVMA动物安乐死指南要求置换率为10%～30%之间，英国动物法案要求置换率为20%。但近期，有报道指出置换率为50%，才可减轻动物安乐死过程的痛苦[7]。还有研究指出，为缓解动物CO2浓度高却未失去意识时可能存在的应激和疼痛反应，应配合其他药物先麻醉动物，再使用CO2进行安乐死[11]。加拿大实验动物安乐死指南以及一些出席2006年和2013年英国纽卡斯尔会议的研究人员，也推荐CO2安乐死前使用其他麻醉剂，但未见有强制要求的报道[12-13]。

本文建立的方法符合目前国际公认的要求，但寻找更人道的安乐死方法是实验动物从业人员共同的目标，如有新的研究成果或做法被广泛认可，本方法也需随之改进和完善。