成年小鼠大脑神经细胞特异性ADAM10基因敲除的认知功能研究*

黄忠兴 何宏星 王亚新 邢作超 周常文 林炤华

(1. 福建医科大学实验动物中心，福州 350122)(2. 福建医科大学基础医学院细胞生物学与遗传学系，福州 350122)

动物行为学研究是一种常用于评价实验动物或模式生物的实验方法，它通过观察实验对象在不同变量下如：食物诱导、环境变化、电刺激等条件下的直观应答，记录实验对象在心理情绪、生理功能等方面产生的变化，并以此了解变量可能对实验动物产生的影响[1-2]。行为学研究常用的实验方法有morris水迷宫[3]、Y迷宫[4-5]、高架十字迷宫[1，6]、旷场实验[6-7]、黑箱实验等。

去整合素和金属蛋白酶10(A disintegrin and metalloproteinase 10，ADAM10)是一种广泛存在于细胞膜表面的蛋白酶。在中枢神经系统中，ADAM10不仅可以通过非淀粉样蛋白水解途径裂解淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)从而抑制了β-淀粉样肽(β-amyloid peptide，Aβ)的形成[8-9]，也可以通过N-钙黏蛋白、Notch等信号途径调控神经元树突的形成与成熟[10]，因此ADAM10与神经退行性疾病特别是阿尔兹海默病密切相关。

本研究利用我们实验室建立的CaMKIIα-Cre转基因小鼠与ADAM10Floxp/Floxp转基因小鼠杂交，繁殖并制备出能够存活至成年的大脑神经细胞特异性ADAM10 cKO(conditional knock-out，条件性基因敲除)小鼠[11]。为了进一步确定本实验室建立的条件性ADAM10基因缺失小鼠模型是否可以作为Alzheimer病的动物模型[12]，我们通过Y迷宫的自发交替与新异探索实验、高架十字迷宫实验以及旷场实验对12月龄的ADAM10 cKO小鼠和对照组C57BL/6 J小鼠进行评估，以了解ADAM10基因的缺失是否会对成年小鼠的自主活动能力及探究学习能力产生影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物和分组

C57BL/6 J成年雄性小鼠10只，由上海斯莱克实验动物有限公司提供(许可证号：SCXK(沪)2012-0002)，作为对照组，大脑神经细胞特异性ADAM10 cKO成年雄性小鼠10只，作为实验组,均为12月龄。动物于实验前一周置于实验室适应环境，室温(23±2)℃，湿度50%左右，自由进食与饮水。

1.2 实验仪器

Y迷宫仪器，共三个臂，各个臂夹角120度，每一臂尺寸为30 cm×8 cm×15 cm(长×宽×高)。高架十字迷宫仪器：由两条开臂70 cm×8cm和两条闭臂70 cm×8cm×5 cm，经中央区8 cm×8 cm连接而成，封闭臂和开放臂的底部离地面50 cm，底面和壁部均漆成白色。旷场仪器：黑色敞口铁皮箱40 cm×40 cm×40 cm，箱底划为16个方格，沿箱壁格称外周格，其余为中央格。实验仪器上方 1.5 m处安置摄像镜头，全过程录像，及SMART 2.0软件系统进行分析(PanLab, Barcelona, Spain)，为深圳瑞沃德公司引进西班牙产品。

1.3 实验方法

1.3.1Y迷宫自发性交替实验: 小鼠由其中一臂的末端放入，自由探索 8 min，实验人员脱离小鼠视线。行动轨迹通过摄像跟踪，依次记录小鼠所进入每个臂的顺序号。由此统计进入通道的总次数(total arm entries)和自发交替率。自发交替率(%)=含全部三个臂序号的三联串总变换次数/进入迷宫臂的可能变换次数(进入臂的总次数-2)×100%[5]。通过Y迷宫自发交替性实验可以评价实验动物的自发活动能力[13]。

1.3.2Y迷宫新异探索实验: 该实验分为两部分，即实验的第一个阶段为训练期，第二个阶段为检测期。新异臂：在实验的第一个阶段即训练期时用隔板遮挡住，在第二个阶段即检测期时打开；起始臂：小鼠进入迷宫时所在的臂。整个实验过程中起始臂和其他臂都是一直打开的，动物可以自由出入。迷宫上方1.5 m处安置摄像镜头，全过程拍摄录像。

1.3.2.1 训练期：新异臂被隔板挡住，小鼠由起始臂放入，在起始臂和其他臂中自由活动10 min，训练结束后，小鼠被放回饲养笼。2 h后进行第二个阶段即检测期的实验。

1.3.2.2 检测期：抽去新异臂的挡板，小鼠由起始臂放入，在3个臂中自由探索活动5 min。录像记录5 min内每只小鼠在各个臂停留的时间和穿梭次数[13]。

1.3.3高架十字迷宫实验: 室内安静暗光。小鼠从中央区面向闭臂放入迷宫，记录6 min内的活动情况，自动摄像系统和计算机分析处理系统记录观察指标：小鼠进入两臂总次数、进入开臂次数、开臂滞留时间，开臂滞留时间%等。可以通过比较小鼠在开臂和闭臂内的滞留时间和路程来评价实验动物的自发探索行为与焦虑行为[6]。

1.3.4旷场实验: 将小鼠放入正中一格。6 s后开始记录6 min内各项行为指标。自动摄像系统和计算机分析处理系统记录观察指标，其中包括：每只小鼠的爬行总距离、中央格进入次数、滞留时间、运行距离%、外周滞留时间、进入边角次数。旷场实验以实验动物在新奇环境之中某些行为的发生频率和持续时间等作为测试指标，通过统计学分析，评价两组小鼠间的自主活动能力和探究行为的差异[7]。

每只小鼠实验结束后用75% 乙醇擦拭、清洗实验仪器，并用纸巾擦拭干净，以最大程度地减少动物通过嗅觉进行的线索识别。

1.4 统计方法

2 结果

2.1 Y迷宫自发交替实验

cKO小鼠的自发交替率(0.50±0.28)%显著小于对照组小鼠(0.74±0.14)%(P<0.05，图1A)。总进臂次数cKO小鼠(10.10±6.74)显著小于对照组小鼠(20.30±8.93)(P<0.05,图1B)。在迷宫中的总活动路程cKO小鼠(5352.85±2213.65)cm显著小于对照组小鼠(8724.81±2396.91)cm(P<0.01,图1C)。

图1 小鼠Y迷宫自发交替实验注：A: 自发交替率；B：进臂总次数；C：活动总路程；数据表示为均数±标准误，n=10；*P<0.05，**P<0.01Fig.1 Spontaneous alternation experiment of Y mazeNote：A: Spontaneous alternation rate;B: total numbers of arm entries; C: total distance moved. Data expressed as means±SEM,n=10; *P<0.05，**P<0.01

2.2 Y迷宫新异探索实验

在新异臂中探索的次数对照组小鼠(5.10±2.23)s显著大于cKO小鼠(2.10±0.74)(P<0.01,图2 A)。两种小鼠探索新异臂所花的时间对照组小鼠(131.32±47.24)s显著大于cKO小鼠(73.61±51.25)s(P<0.05,图2B)。对照组小鼠在新异臂中活动的路程(2771.50±868.51)cm显著大于cKO小鼠(920.07±305.98)cm(P<0.001,图2C)。

图2 小鼠Y迷宫新异探索实验注：A：新异臂探索次数；B：新异臂探索时间；C：新异臂探索路程；数据表示为均数±标准误，n=10；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001Fig.2 New exploration experiment of Y mazeNote：A:munbers of times entering new arm; B: new arm time; C: distance in the new arm.Data expressed as means±SEM,n=10; *P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

2.3 高架十字迷宫实验

从实验结果来看，开臂进入次数对照组小鼠(8.5±1.7)显著小于cKO小鼠(13.1±1.2)(P<0.05，图3A)。开臂滞留时间对照组小鼠(46.5±9.3)显著小于cKO小鼠(86.4±15.3)s(P<0.05，图3B)。开臂滞留时间占总时间百分比对照组小鼠(12.9±2.5)显著小于cKO小鼠(24.2±4.2)%(P<0.05，图3C)。

图3 小鼠高架十字迷宫实验注：A: 进入开臂次数；B：开臂滞留时间；C：开臂滞留时间占总时间百分比；数据表示为均数±标准误，n=10；*P<0.05Fig.3 mouse in elevated plus mazeNote：A: open arm entries; B: open arm time; C:percent of open arm/total time.Data expressed as means±SEM,n=10; *P<0.05

2.4 旷场实验

从总体情况来看，对照组小鼠在6 min内的活动总路程为(7479±580.4)cm，cKO小鼠总路程为(6408±890.3)cm，二者无显著性差异(P>0.05，图4A)。对照组小鼠进入中央区的次数(56.2±11.7)显著大于cKO小鼠(18.2±5.4)(P<0.001,图4B)；两种基因型小鼠进入周边区的次数分别为对照组小鼠(35.7±4.4)、cKO小鼠(35.4±5.7)两者无显著差异(P﹥0.05,图4B)。从中央区活动路程占总路程的百分比来看，对照组小鼠(24.0±4.9)与cKO小鼠(7.8±1.7)之间无显著差异(P=0.06,图4C)。对照组小鼠在中央区的滞留时间(66.9±20.4)s显著大于cKO小鼠(13.9±5.0)s(P<0.05)；周边区滞留时间对照组小鼠(292.2±20.2)s显著小于cKO小鼠(345.4±4.9)(P<0.05，图4D)。

图4 小鼠旷场实验注：A：活动总路程；B：进入中央区和周边区的次数；C：中央区活动路程占总路程百分比；D：中央区和周边区滞留时间；数据表示为均数±标准误，n=10，*P<0.05，***P<0.001Fig.4 Mouse in open field testNote：A:total distance moved;B: number of times entering the central area and out ring; C: percent of central area/total distance;D: time of central area and out ring. Data expressed as means±SEM,n=10， *P<0.05，***P<0.001

3 讨论

在评估神经退行性疾病的动物模型中，Y迷宫的研究应用十分广泛，它是研究动物自发活动能力和对空间辨别的学习记忆能力的常用实验方法[4-5]。为了进一步确定本实验室建立的条件性ADAM10基因缺失小鼠模型是否可以作为Alzheimer病的动物模型，ADAM10的缺失又是否会对成年小鼠的活动能力及其空间辨别的学习记忆能力有影响。我们通过Y迷宫的方法对12月龄的ADAM10 cKO小鼠和对照C57BL/6 J成年小鼠进行实验。结果表明，ADAM10 cKO小鼠与野生型C57BL/6 J小鼠相比较，其自发交替活动减少，活动能力下降，对新异空间的探索能力也有所下降。为了避免由于长时间实验导致小鼠活动能力降低继发性引起实验数据的偏差。实验中，随机安排不同的小鼠对应Y迷宫的起始臂、新异臂和其他臂，但是对于同一只小鼠而言，在迷宫实验的两个阶段，三个臂是固定的。由于小鼠对该迷宫测试的记忆时间最长不超过数小时，所以该迷宫测试可以在同一只小鼠上反复进行，但是两次实验间隔需至少一周时间，并需改变三个臂的搭配。评价空间识别记忆能力可以用小鼠在新异臂中停留的时间和穿梭的路程作为检测指标，记忆损害者在新臂中探索的时间和路程会缩短。这说明ADAM10基因缺失降低了成年小鼠的活动能力和其对空间辨别的学习记忆能力。ADAM10的缺失对小鼠造成了小鼠行为学方面的改变。

高架十字迷宫利用小鼠面对新事物(开臂)时会产生好奇心去探究,同时它们又有嗜暗的天性(闭臂),当两者之间发生探究与回避的冲突时,容易引发焦虑心理，因此可以通过比较小鼠在迷宫开臂和闭臂中的行为表现来评估焦虑程度。在高架十字迷宫中，较对照小鼠，ADAM10 cKO 活动轨迹更复杂，并且统计结果指标明显增加，即活动总次数、进入开臂次数、开臂滞留时间s、开臂滞留时间%均有显著增加。ADAM10 cKO小鼠在复杂环境中主动活动能力提高，焦虑感降低。这可能是由于ADAM10基因缺失后引起的神经元树突突触前膜的损伤，导致神经信号传递的异常，进一步引发小鼠焦虑感减弱，从而表现为在复杂环境下的低焦虑状态和主动活动能力的提高。

在旷场实验中，较对照小鼠，ADAM10 cKO 小鼠活动轨迹显然更简单，统计数据指标降低，即爬行总距离缩短，中央爬行距离%降低，进入边角次数和中央滞留时间显著减少；而外周滞留时间明显延长。张玲和林燕利用已构建的APP转基因鼠和APP/ADAM10双转基因鼠来研究小鼠的行为学变化，发现，高架十字迷宫实验中，与对照组小鼠相比，APP/ADAM10双转基因鼠活跃程度增加；旷场实验中，与对照组小鼠相比，APP/ADAM10双转基因鼠活跃程度均降低[14]。Prox等研究发现：在高架十字迷宫实验中，较对照小鼠，ADAM10 cKO组小鼠行动更加活跃；在旷场实验中，较对照小鼠，ADAM10 cKO小鼠的社交活动探索能力减弱[15]。本文实验结果与文献报道中一致。与对照相比，ADAM10cKO小鼠焦虑情绪减弱，自主活动能力和探究行为能力较差。

综上所述，本研究利用Y迷宫自发交替实验、Y迷宫新异臂探索实验、高架十字迷宫实验和旷场实验评估了ADAM10 cKO小鼠的自主活动能力和探究学习能力，其结果表明小鼠中枢神经系统神经元ADAM10基因的缺失对小鼠的记忆和学习能力产生了明显影响。