同时检测小鼠微小病毒(MVM)和小鼠细小病毒(MPV)的荧光定量PCR的建立及应用*

王淑菁 林 欢 付 瑞 李晓波 王 吉 岳秉飞 贺争鸣

(1.中国食品药品检定研究院实验动物资源研究所，北京 100050) (2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，哈尔滨 150001)

细小病毒感染是啮齿类实验动物常见的病原体感染之一。小鼠微小病毒(MVM)和小鼠细小病毒(MPV)两种细小病毒均曾在小鼠中被分离得到。MVM易污染鼠源性细胞，比如 CHO细胞系中就曾分离到过MVM。MPV是鼠脾细胞培养物潜在的污染物。细小病毒感染小鼠，通常无症状临床表现，但研究表明，在涉及免疫系统、肿瘤和移植的实验中，体内、外感染MVM和MPV将会严重影响实验数据的准确性和可信性[1-3]。

FELESA、Charles River、日本实中研等实验室关于实验小鼠健康监测的指南中，规定了需要对MVM和MPV两种细小病毒均进行检测。我国的国标中仅规定对实验小鼠进行MVM检测，国内尚未开展实验小鼠感染MPV的研究。本研究拟将建立同时检测MVM和MPV的荧光定量PCR方法，初筛样本中是否存在细小病毒感染，再使用本实验室已建立的MVM、 MPV特异性荧光定量PCR方法鉴定是哪种细小病毒感染[4]。不仅可以实现对免疫缺陷小鼠、细胞系及生物原材料的细小病毒检测，还可以进行大样本的病毒筛查和鉴定。

1 材料与方法

1.1 病毒

小鼠微小病毒(MVM)、猪细小病毒、大鼠细小病毒H-1株和KRV株均购自美国ATCC。

1.2 主要试剂

Takara MiniBEST Viral RNA/DNA 提取试剂盒购自TaKaRa公司；TaqMan Universal PCR Master Mix购自Applied Biosystems公司。

1.3 引物和探针的设计

根据NCBI上发表的MVM(NC_001510)和MPV(NC_001630.1)基因组序列，通过BLAST比对分析分别选择保守特异区域设计引物和探针，选择MVM和MPV共有序列设计引物和探针。见表1。

表1 MVM-MPV荧光定量PCR的引物和探针Table 1 Primer and probe sequence for MVM-MPV real time PCR assays

1.4 MVM-MPV标准质粒的制备

本实验室无MPV毒种，仅有MVM毒种，需要建立MVM-MPV质粒标准品。人工合成MVM(NC_001510)基因组2011-2240 DNA序列，该序列为MVM和MPV共有序列，转入pMD19-T质粒中，作为MVM-MPV质粒标准品。

1.5 荧光定量PCR方法反应体系及反应条件

PCR反应体系为：TaqMan Universal PCR Master Mix 10 μL，探针引物混合物(10 μmol/L)1 μL，无RNA酶水7 μL，模板2 μL。反应条件：50 ℃ 2 min；95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1min，40个循环。

1.6 考察特异性

提取MVM、大鼠细小病毒H-1株和KRV株、猪细小病毒的DNA，进行荧光定量PCR，考察该引物和探针的特异性。

1.7 考察敏感性

倍比稀释构建的质粒标准品，从109至100拷贝/μL，每个稀释度重复3次，考察该方法的灵敏度，以阳性检出率为100%的最低稀释倍数为该方法的灵敏度。

1.8 初步应用

使用建立的荧光定量PCR方法检测2014—2015年送检的178份清洁级小鼠粪便。

2 结果

2.1 标准曲线的绘制及最佳线性范围的确定

当MVM-MPV标准质粒分别在109～104拷贝/μL时， R2值可达0.99，R2值越接近1，代表标准曲线的线性关系越好。见图1。

图1 MVM-MPV荧光定量PCR标准曲线Fig.1 The standard curve of MVM-MPV real-time PCR

2.2 考察特异性

检测结果显示，当检测MVM病毒和MVM-MPV标准质粒时，均出现FAM荧光扩增曲线。检测大鼠细小病毒H-1株、大鼠细小病毒KRV株、猪细小病毒均无明显扩增曲线。表明所建立的荧光定量PCR法特异性强，与其他细小病毒均无交叉反应。

2.3 考察敏感性

倍比稀释构建的质粒标准品，从109至100拷贝/μL，以阳性检出率为100%的最低稀释倍数为该方法的灵敏度，检测结果显示，该方法检测MVM-MPV标准质粒的灵敏度为101拷贝/μL。见图2。

图2 MVM-MPV荧光定量PCR方法的灵敏度Fig.2 The sensitivity of MVM-MPV real-time PCR

2.4 初步应用

2.4.1MVM-MPV荧光定量PCR初筛176份清洁级小鼠粪便：对2014—2015年送检的178份清洁级小鼠粪便样本，提取DNA后应用MVM-MPV荧光定量PCR进行初筛，检测显示出现两份阳性样本。

2.4.2应用本实验室建立的MVM荧光定量PCR和MPV荧光定量PCR分别检测阳性样本，以确定为哪种细小病毒感染，检测结果显示，2份阳性样本均检测为MVM阴性，MPV阳性。

2.4.3阳性样本测序：将两份阳性样本DNA送至北京擎科新业生物技术有限公司进行全基因组测序，测序得到可信的碱基序列4 016 bp，在 NCBI上进行序列比对，结果显示与MPV(NC_001630.1)的序列一致率可达96%，确定两份阳性样本感染的病毒为MPV。见图3。

图3 序列比对结果注：Identities为两段序列的一致性；比对序列1为测序得到的4 016 bp碱基序列；比对序列2为MPV基因组序列(Mouse parvovirus 1,序列号NC_001630.1)；比对结果为两段序列中有3 843 bp序列完全一致，一致率为96%Fig.3 BLAST resultNote： Identities is the consistent rate of two sequences. The first sequence is the sequence of 4 016 bp base obtained by sequencing and the second sequence is the MPV genome sequence (Mouse parvovirus 1, complete genome, sequence number NC_001630.1). The blast result showed that the 3 843 bp sequences of the two sequences were identical,and the concordance rate was 96%.

3 讨论

细小病毒并不引起小鼠明显临床疾病和组织学病变，但细小病毒可通过对小鼠体内免疫调节的影响，从而对实验研究的结果造成严重偏差。因此，开展MVM和MPV的检测，对于实验小鼠以及鼠源性生物材料或鼠源性细胞系具有重要意义[5]。

国外对实验小鼠进行细小病毒检测时发现，MPV感染占77%，MVM感染占16%，而混合感染占7%[6-7]。Wang等检测台湾地区178份小鼠脾脏DNA样品中，20份样品为MPV阳性，178份样品MVM检测均为阴性。MPV的感染率(11.5%)高于欧美国家(1%～3%)，MVM的感染率与欧美国家(低于0.5%)相似[8]。国内在细小病毒研究，尤其是实验小鼠MPV研究方面报道较少[4,9-10]。

本研究中建立的小鼠MVM-MPV荧光定量PCR方法，最佳线性范围为109～104拷贝/μL，标准曲线的线性关系良好，灵敏度均为101拷贝/μL，特异性强，仅扩增其对应的细小病毒。应用MVM-MPV探针对178份清洁级小鼠粪便DNA进行初筛，检测出2份阳性样本，经MVM、MPV特异性探针鉴定，确认均为MPV感染。将阳性样本进行全基因组测序，与NCBI上MPV(NC_001630.1)序列比对，结果显示其一致率可达96%，验证了所建立方法的可靠性。目前本实验室只有MVM毒种，没有MPV毒种，本次筛查检测出的MPV阳性样本可进一步分离MPV活病毒。目前国标中并未规定实验小鼠中必须进行MPV检测，研究中检测到MPV阳性，需要引起实验动物科技工作者的重视。本研究中建立的小鼠MVM-MPV荧光定量PCR方法，为同时检测MVM、MPV，研究细小病毒感染情况提供了有效的技术支持。