应用实时荧光定量PCR方法检测实验用猫巴尔通体的感染*

冯育芳 邢 进 王 吉 付 瑞 岳秉飞

(中国食品药品检定研究院实验动物资源研究所，北京 100050)

猫(Cat, Felidae)来自于哺乳纲食肉目猫科猫属，自古作为人类的宠物存在。鉴于猫与人类的密切关系及其特殊的生理特点，猫从19世纪末开始被用于实验研究[1-2]。但由于繁殖和饲养上的困难，猫的实验化进展较为缓慢。近年来的研究发现，猫可以耐受麻醉及部分脑破坏手术，而且在手术时能保证正常血压，这与人的反射功能近似；此外，猫的循环系统、神经系统和肌肉系统发达，可用于相关研究。因此，猫作为实验用动物在医学、生物学等研究领域的应用越来越广泛[3]，在某些实验中，如降压实验、作为弱视动物模型[4]、脑出血模型[5]及高眼压动物模型等方面具有不可替代的作用[3]。

巴尔通体(Bartonella)是一群革兰氏染色阴性、营养条件要求苛刻的需氧杆菌。巴尔通体由吸血节肢动物传播，已证实能感染多种温血动物(犬、猫、啮齿动物)和冷血动物(爬行类、两栖类)脊椎动物[6]，引起巴尔通体病。流行病调查显示，家猫是汉赛巴尔通体(Bartonellahenselae)和克氏巴尔通体(Bartonellaclarridgeiae)的主要宿主。而猫携带的巴尔通体可以通过白蛉、跳蚤、蜱、虱及恙螨等昆虫媒介传播给人，可引起人类卡瑞恩病、战壕热、猫抓病、心内膜炎、菌血症等疾病，是一种广泛存在的人兽共患病原[7]。基于此，国内外实验动物微生物标准已要求检测并排除该菌。

基于猫普遍携带巴尔通体的现状和实验动物的微生物质量控制要求，建立一种灵敏度高、特异性强的巴尔通体检测手段是非常必要的。目前用于诊断该病的方法有细菌培养分离法、ELISA和PCR等，细菌培养分离存在费时、操作繁琐、无法定量等缺点；血清学诊断方法存在巴尔通体亚种间的交叉问题[8]。实时荧光定量PCR方法将PCR与荧光检测方法相结合，具有操作简便、结果直观、敏感性高、特异性强、重复性好等优点，已成为病原检测的重要方法，可满足当前对猫巴尔通体的检测需要。猫巴尔通体实时荧光定量PCR方法的建立将为猫的微生物检测和猫的实验动物化奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌株

伊丽莎白巴尔通体(B.elizabethae, 49227)、汉赛巴尔通体(B.henselae, 49882)、克氏巴尔通体(B.clarridgeiae, 51734)和拉汉姆巴尔通体(B.grahamii,Birtles, 700132)购自ATCC，均为我国主要流行的巴尔通体菌株。用于特异性检测菌株分别为：肺链(31210)、肺链(36001)、乙链(32310)、小鼠放线(49577)、支败(19395)、支败(58401)、嗜肺(12555)、嗜肺(35149)、多杀(43137)、鼠棒(65013)、李斯特(54004)、支原体(MP)和支原体(15531)均由本实验室保存鉴定。

1.2 主要试剂

Qiagen DNA提取试剂盒(51304，54161)购自凯杰企业管理(上海)有限公司，OXIOD哥伦比亚血琼脂(CM0031B)购自北京兰伯瑞生物技术有限公司，ABI荧光定量2×MIX(4369016)购自英潍捷基公司。

1.3 引物设计

从Genbank获取巴尔通体RIBC基因序列，根据其保守片段设计特异引物和TaqMan探针，由TAKARA公司合成，引物及探针序列见表1。

表1 TaqMan实时荧光定量PCR方法引物与探针序列Table 1 Primers and probe used in TaqMan Real-Time PCR assay

1.4 标准品的制备

使用基因工程技术构建ABJ 1311重组质粒，质粒含长度为562 bp的目标序列，质粒转染工程菌，后细菌培养并提取质粒，特异性PCR鉴定，酶切鉴定结果正确，说明成功制备了标准品质粒。用紫外分光光度法测定标准品质粒，在波长260 nm测吸光度A值，计算质粒拷贝数，稀释质粒到1×1010copies/μL，分装后-80 ℃冻存，用前进一步稀释。

1.5 荧光定量PCR方法反应体系及反应条件

参考荧光定量PCR试剂盒说明书，建立扩增猫巴尔通体的反应体系(表2)，并进行条件优化，最终确定本实验的反应条件为：(1) 50 ℃ 2min (2) 95 ℃ 10 min (3) 95 ℃ 15sec，57 ℃ 1min，40 cycle。在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。

表2 Real-time PCR反应体系Table 2 The reaction system of Real-time PCR

1.6 样本采集及DNA提取

无菌采集实验用猫静脉血500 μL，去血清后，吸取所有血块用于提取DNA；对照菌株纯培养后直接提取DNA，DNA提取使用天根的血块提取试剂盒(Cat. DP335-02)，详细操作根据产品说明书进行。

1.7 特异性测定

另取本室保存的菌种：肺链(31210)、肺链(36001)、乙链(32310)、小鼠放线(49577)、支败(19395)、支败(58401)、嗜肺(12555)、嗜肺(35149)、多杀(43137)、鼠棒(65013)、李斯特(54004)、支原体(MP)和支原体(15531)，按上述方法提取DNA，进行PCR扩增，检测不同细菌种间PCR扩增的特异性。

1.8 敏感性测定

对照菌株纯培养后，按上述方法直接提取DNA，将提取的DNA倍比稀释为10 μg/mL、1 μg/mL、1.0×10-1μg/mL、1.0×10-2μg/mL、1.0×10-3μg/mL、1.0×10-4μg/mL、1.0×10-5μg/mL、1.0×10-6μg/mL、1.0×10-7μg/mL、1.0×10-8μg/mL、1.0×10-9μg/mL、1.0×10-10μg/mL，用上述PCR方法进行测定，以确定其检测阈值。

2 结果

2.1 标准曲线制作

使用分光光度计测定，并计算巴尔通体ABJ 1311质粒DNA拷贝数，拷贝数为1×1010copies/μL。根据测得的质粒浓度，将ABJ 1311质粒10倍系列稀释，做10个稀释度，作为模板进行实时定量荧光PCR，建立标准曲线，如图1所示，1～10分别为10个稀释度，分别为1.0×109copy/μL～1.0×100copy/μL。

图1 标准曲线注：图中红色方块为质粒标准品。Fig.1 Standard curveNote：The red blocks stand for standard

2.2 荧光定量PCR方法的敏感性、特异性及稳定性分析

为测定该PCR方法的敏感性，选取汉赛巴尔通体(49882)培养液DNA提取物，使用无RNA酶水做10个稀释度，从1.0×100copy/μL～1.0×109copy/μL，A～J为10倍系列稀释结果，从图2可见本实验方法最高可检测1.0×101copy/μL，灵敏度较好。图3为特异性结果，我们用与巴尔通体毒种亲缘关系较近的几个菌株做对照，同时进行荧光定量PCR方法的特异性分析，A～E为标准品，剩下的包括阴性对照、肺链(31210)、肺链(36001)、乙链(32310)、小鼠放线(49577)、支败(19395)、支败(58401)、嗜肺(12555)、嗜肺(35149)、多杀(43137)、鼠棒(65013)、李斯特(54004)、支原体(MP)和支原体(15531)，结果显示，对照菌株均未见非特异性扩增曲线的出现，即该PCR方法的特异性较高。

图2 荧光定量方法灵敏度结果Fig.2 The sensibility test

图3 荧光定量PCR方法的特异性Fig.3 The specificity test

图4 猫巴尔通体荧光定量PCR方法的应用Fig.4 The result of samples from cat by the real-time PCR assay

2.3 使用巴尔通体实时荧光定量PCR方法检测猫的感染情况

从北京采集142份猫血样，提取DNA，并用优化后的PCR方法扩增特异性片段，以检测是否存在巴尔通体的感染。在这些样品中，发现其中4、6、7、18、32及57为阳性，如图4所示。实验用猫中巴尔通体的感染率为4.23%。

3 讨论

巴尔通体(Bartonella))是一群革兰氏染色阴性、营养条件要求苛刻、兼性细胞内寄生的需氧杆菌[9]。《伯杰氏系统细菌学手册》(2004)将之归录于变形菌纲、a亚纲、根瘤菌目、巴尔通体科、巴尔通体属，列出21个种及亚种[10]。致病性巴尔通体有杆菌样巴尔通体、五日热巴尔通体、汉赛巴尔通体(B.henselae)、克氏巴尔通体(B.clarridgeiae)、伊丽莎白巴尔通体(B.elizabethae)等9种，可引起人类卡瑞恩病(carrion’s disease)、战壕热、猫抓病(cat scratch disease，CSD)、心内膜炎、菌血症和HIV感染者的杆菌性血管瘤(bacillary angiomatosis，BA)等疾病[9, 11]。人类可能因为与寄生巴尔通体的猫、狗等动物较为亲近的接触或偶然接触自然环境中的啮齿类等野生动物而感染巴尔通体或致病[10]。因此，对于携带巴尔通体的动物(如猫、狗)需要加强检测和防范，避免不必要的动物源性感染和疾病的出现。

随着科学技术的不断进步，猫在生物医药研究中的应用越来越广泛[3]。鉴于其独特的生理特征，猫主要被用于神经学、生理学和毒理学的研究。在某些研究中，如降压实验、弱视动物模型及高眼压动物模型等，猫具有不可替代的作用[12]。猫还可较好地耐受麻醉和手术，而且手术时其能保持正常血压。在药品的降压物质检查中，猫作为中国药典规定的实验动物。而且，猫越来越多地被用于形觉波剥夺性弱视、食管病、精子发育、卵泡发育等研究[3, 13-15]。因此，猫已具有成为实验动物的潜力，而检测其微生物背景为猫实验动物化的前提和基础。研究表明，4%～80%家猫携带有汉赛巴尔通体的抗体，10%～60%家猫感染了克氏巴尔通体，感染率存在明显的地区差异及混合感染现象[16]。而且，1岁以下的小猫带菌率比成年猫高。家猫带菌可持续数周到几年不等。因此，建立针对猫的巴尔通体检测方法刻不容缓。

之前，大部分动物巴尔通体的调查研究使用的是细菌培养方法[17]，该方法为细菌检测的经典方法，但操作繁琐，灵敏性低，时效性差。近来，随着分子生物学技术的普及，也有部分实验使用了PCR方法，陈武等人为快速准确检测华南虎感染的血巴尔通体种类，根据猫血巴尔通体的16S rRNA基因序列设计引物进行PCR检测，结果发现华南虎感染的血巴尔通体为大型猫血巴尔通体[18]。姚美琳等人建立了灵敏、特异的SYBR-Green荧光定量PCR检测巴尔通体的方法，以用于巴尔通体的实验室快速诊断和自然疫源地的流行病学研究[19]。Sato等人使用巢氏PCR方法检测了1754份猫血清样品中汉赛巴尔通体和克氏巴尔通体的流行情况，发现4.6% (80/1754)样品为PCR阳性，其中48.8% (39/80)为汉赛巴尔通体感染，33.8% (27/80)为克氏巴尔通体感染，17.5% (14/80)为共感染[20]。但由于巴尔通体的高度流行及基因型别的多样性，有必要建立猫巴尔通体实时荧光定量PCR检测方法。

本研究通过引物、探针设计，扩增条件优化，标准曲线的制备，灵敏性和特异性分析，成功建立了猫巴尔通体实时荧光定量PCR检测方法，该方法线性范围为1.0×101copies/μL～1.0×109copies/μL，相关系数为0.998，检测极限达10 copies/μL，特异性良好；在142个实验用猫样品中检测出阳性样品6个。其次，本研究在北京来源猫中检出巴尔通体，提示北京来源猫也存在巴尔通体的感染，而且相对其他动物，如姬鼠属(Apodemus) (62.2%, 28/45)，家鼠属(Rattus) (41.5%, 27/65)，绒鼠属 (Eothenomys) (18.8%, 3/16)[21]，猫巴尔通体属于低等程度流行(4.23%, 6/142)，鉴于实验动物种群属于高密度饲养，猫巴尔通体感染情况也应该引起实验动物科技界足够的重视。因此，本研究建立了猫巴尔通体实时荧光定量PCR方法，为今后的猫病原检测和动物实验研究提供了有效的实验手段，初步检测了巴尔通体在北京地区猫群体中的流行情况，为猫的微生物检测和猫的实验动物化奠定基础。