透明质酸修饰阿霉素脂质体的制备及抑制肿瘤细胞生长活性

黄 燕， 邱立朋， 朱梦琴， 宿丹丹， 陈敬华

（江南大学 药学院，江苏 无锡 214122）

脂质体是磷脂分散在水中时形成的脂质双分子层闭合囊泡[1]，其各层之间被水相隔开，在水中平衡后具有亲水性和疏水性两性性质，被作为药物载体以控制药物释放，减少毒性，提高疗效。阿霉素（Doxorubicin，DOX）是有效的抗肿瘤药物之一，但其具有严重的心脏毒性等毒副作用[2]。通过脂质体包裹阿霉素静脉注射，能够减少阿霉素的心脏分布，降低心脏毒性，提高抗肿瘤疗效[3-4]。然而，普通脂质体存在肿瘤靶向性不足的缺点，因此，通过生物材料对其表面进行修饰是一种提高脂质体靶向性和稳定性，增强细胞内吞能力，延长体内循环作用时间的有效手段[5]。

透明质酸（Hyaluronic acid，HA）是一种广泛存在于体内各组织中的大分子链状黏多糖[6]。HA结构中有羧基、羟基和酰胺键，使其利于载体材料的修饰。研究表明，细胞表面CD44、RHAMM、LYVE-1和HARE等是HA的四类特异性受体[7]。其中，CD44是细胞表面最重要的HA受体[8]。与正常细胞相比，CD44受体在乳腺癌、卵巢癌、肺腺癌等多种恶性肿瘤细胞表面过表达[9]。根据受体-配体理论，HA作为抗肿瘤药物靶向载体时，能与肿瘤细胞表面的CD44受体特异性结合，使更多的抗肿瘤药物分子靶向进入肿瘤细胞内，提高抗肿瘤药物的药物疗效[10-12]。

因此，为提高脂质体的细胞内吞能力及主动靶向性，延长循环时间，并增大疏水性药物携载能力，作者制备了HA修饰的DOX脂质体。通过HA与十八烷胺（Octadecylamine，OA）进行反应透明质酸-十八烷基（Hyaluronic acid-Octodecane，HOA）聚合物，然后通过后插入法制备HOA修饰的DOX靶向脂质体（DOX/LP/HOA），并对其物理化学性质及体外抑制肿瘤细胞生长活性进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 HA（相对分子质量5 300）：购自华熙福瑞达生物医药有限公司；大豆磷脂（纯度98%）：购于上海太伟有限公司；胆固醇：购于上海生工生物工程股份有限公司；十八烷胺、N-羟基琥珀酰亚胺 （NHS）、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺（EDC）：购于上海晶纯生化科技股份有限公司；三乙胺（TEA）、甲酰胺、N，N-二甲基甲酰胺酰胺（DMF）、二氯甲烷（CH2Cl2）二胺四乙酸二钠（EDTA）：购自购自国药集团化学试剂公司。反应用的溶剂使用前均需重蒸纯化。

1.1.2 仪器 RV10BS96旋转蒸发仪：德国IKA仪器设备有限公司制造；DF-101S型恒温加热磁力搅拌器：郑州科泰实验设备有限公司制造；AVANCEⅢ型核磁共振仪：瑞士Bruker公司制造；UV-1800型紫外分光光度计：日本岛津仪器有限公司制造；FreeZone冷冻干燥仪：美国Labconco公司制造；Zetasizer Nano ZS纳米粒度分析仪：英国Malven公司制造；JY92-ⅡN型超声波细胞粉碎机：宁波新芝生物科技股份有限公司制造；JEM-2100型透射电子显微镜：日本Jeol公司制造；Multiskan Go型酶标仪：美国Thermo公司制造。

1.1.3 细胞 MCF-7细胞：购自中国科学院保藏中心（上海）。

1.2 HOA的合成及结构确证

精确称取HA 100 mg溶于10 mL无水甲酰胺中，加入100 mg EDC和60 mg NHS，冰浴下磁力搅拌2 h。称取72 mg OA胺溶于5 mL无水DMF，将其缓慢滴入上述HA混合液中，30℃氮气环境下搅拌反应40 h。反应结束后，将反应液装入透析袋（截留相对分子质量3 500）中，于过量的水/乙醇混合液（1/3~1/1）中依次透析1 d，去离子水中透析2 d，0.45 μm水系滤膜过滤后，冷冻干燥得白色HOA聚合物[13-14]，用核磁共振波谱（1H NMR）确定其结构。

1.3 脂质体制备

1.3.1 阿霉素碱基的制备 精密称量30 mg盐酸阿霉素，将其溶于30 mL甲醇溶液中，加入30 μL三乙胺，室温下避光搅拌过夜，旋转蒸发除去有机溶剂后，再加入四氢呋喃复溶，得到1 mg/mL的阿霉素碱基溶液，避光保存。

1.3.2 脂质体的制备 采用薄膜分散法制备载DOX普通脂质体 （DOX/LP）。精确称取大豆磷脂400 mg，胆固醇50 mg，加入10 mL无水乙醚使其溶解后，置于500 mL的圆底烧瓶中。精密量取2 mL含DOX的四氢呋喃溶液，缓慢滴加至上述溶液中，80 r/min条件下于旋转蒸发仪上减压蒸发，除尽有机溶剂，脂质则均匀地分布在圆底烧瓶内表面。加入10 mL磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffered Saline，PBS，pH 7.4）振摇，水化 30 min，使脂质膜充分水合溶胀，得均匀白色混悬液。然后将所得到的初脂质体再冰浴超声10 min（超声功率400 W，工作5 s，间歇5 s），离心5 min，除去未载入的药物，即得DOX/LP。

采用后插入法制备HA修饰的靶向脂质体（DOX/LP/HOA）[15]。取适量 HOA胶束溶液滴入DOX/LP中，50℃下恒温孵育2 h，冷却后得（DOX/LP/HOA）。

1.4 粒径、zeta电位及形貌表征

取适量脂质体溶液于测量杯内，通过Malven纳米粒度分析仪测定脂质体的粒径、粒径分布及zeta电位值。

将上述脂质体溶液混合均匀后，滴至覆有支持膜的铜网上，待液体挥干后用2%磷钨酸钠负染，室温干燥，用透射电镜（TEM）观察其外貌形态。

1.5 包封率的测定

1.5.1 检测波长的选择 分别取空白HOA修饰的脂质体和DOX溶液，稀释至一定浓度，用紫外分光光度计在200~700 nm范围内进行紫外扫描，确定DOX的检测波长。

1.5.2 DOX标准曲线的测定 精确称取阿霉素10 mg，置于容量瓶中，用纯水溶解并定容至100 mL，配制成100 μg/mL的母液。精密量取适量DOX母液置于10 mL的棕色容量瓶中，纯水稀释定容得到1、2、8、12、16、32、40 μg/mL 的系列 DOX 标准溶液。利用紫外分光光度计测定阿霉素的紫外吸收值，以吸光度A对DOX的质量浓度c作图，绘制标准曲线。

1.5.3 精密度的测定 按照上述方法分别配制2、12 μg/mL 和 32 μg/mL 的低、中、高质量浓度待测溶液，在同一天的内测定5次，计算日内精密度，并连续测5天计算日间精密度。

1.5.4 回收率的测定 取0.5 mL空白脂质体溶液，加入阿霉素储备液适量，稀释至质量浓度分别2、12、32 μg/mL 的低、中、高质量浓度待测溶液，测定吸光度，并按照标准曲线计算回收率。

1.5.5 包封率的测定 采用超速离心法测定包封率[16]。精确量取1.5 mL脂质体于截留相对分子质量为3 000的超滤杯中，10 000 r/min离心30 min，测定滤出液吸光度，计算得到药物的包封率（EE）。

1.6 体外释放

采用动态透析法考察载药脂质体的体外释放行为。取2 mL DOX/LP和DOX/LP/HOA置于透析袋内（截留相对分子质量为3 500），封口后投入装有10 mL、pH 7.4的PBS释放介质的棕色瓶中，于（37±0.5）℃、100 r/min避光振摇。 分别于不同时间点取样1 mL，同时补充相同体积和温度的新鲜PBS。利用紫外分光光度法测定样品的吸光度值，计算累积释放百分数。

1.7 抑制肿瘤细胞生长活性评价

取处于对数生长期的MCF-7细胞，以6×103个/孔接种于96孔板，37℃、5%CO2条件下培养24 h，分别加入 100 μL 的游离 DOX、DOX/LP、 DOX/LP/HOA溶液，同时设空白对照组。孵育48 h后，吸去含药培养液，每孔加入100 μL的MTT溶液（0.5 mg/mL），继续孵育4 h。然后每孔加入100 μL的DMSO用酶标仪测定每孔的吸光度值（OD），并计算细胞存活率，评价其抑制肿瘤细胞生长的活性。

2 结果与讨论

2.1 HOA合成及表征

利用十八烷胺上的氨基与HA结构中的羧基进行反应，制备HOA聚合物，合成过程见图1。通过1H-NMR谱图对HOA聚合物结构进行确证见图2。其中，1.95 μg/g为HA结构中乙酰甲基的特征峰，0.83 μg/g和1.23 μg/g处出现新的特征峰，为十八烷基长链中甲基和亚甲基的特征峰，这表明成功合成了HOA聚合物。

图1 HOA的合成路线图Fig.1 Synthesis route of HOA conjugate

图2HOA和HA的1H-NMR谱图Fig.2 1H-NMR spectra of HOA and HA

2.2 粒径及zeta电位

DOX/LP和DOX/LP/HOA的粒径、多分散指数及zeta电位值见表1。可以看出，制备得到的脂质体粒径较小，经HOA修饰后，脂质体粒径及PDI值无明显变化，zeta电位有所下降。DOX/LP/HOA负的zeta电位能够有效防止粒子聚集，增加脂质体稳定性，同时可以避免血浆蛋白的吸附，提高在血液中的循环稳定性。此外，图3显示DOX/LP/HOA脂质体粒径分布较窄，形貌为球形或类球形。

表1 不同脂质体的粒径、多分散指数及zeta电位值（n=3）Table 1 Sizes，PDI andzeta potential of different liposomes（n=3）

图3 DOX/LP/HOA粒径分布图及透射电镜图Fig.3 Size distribution and TEM micrograph of DOX/LP/HOA

2.3 载药量测定

2.3.1 阿霉素吸收波长 用紫外分光光度法对空白脂质体和DOX溶液的全波长进行扫描，结果见图4。DOX在480 nm处有最大吸收峰，而空白脂质体在此波长并无吸收，不干扰药物质量浓度测定，故选择紫外分光光度计作为DOX质量浓度的检测方法，检测波长为480 nm。

图4 空白脂质体和DOX的紫外全波长扫描图谱Fig.4 UV-scanning spectrometry of blank liposomes and DOX

2.3.2 阿霉素标准曲线 以吸光度（A）对阿霉素质量浓度（c）作图，得到DOX回归方程为：A=0.018 5c-0.001 5（r=0.999 7），结果表明阿霉素在 1~40 μg/mL范围内有良好的线性相关性，可用于DOX的定量分析。

2.3.3 精密度 质量浓度为 2、12、32 μg/mL的阿霉素标准溶液的日内精密度和日间精密度结果见表2。结果表明该方法的重复性良好，各个质量浓度的精密度RSD值均小于2%，符合方法学要求。

2.3.4 回收率 质量浓度为 2、12、32 μg/mL的阿霉素标准溶液的平均回收率分别为100.24%、99.14%和98.95%，RSD值在0.67~1.53，说明该方法的回收率良好。

表2 阿霉素精密度的测定（n=5）Table 2 Precision determination of DOX（n=5）

2.4 包封率

通过超速离心法测定DOX/LP包封率为（95.4±0.32）%，DOX/LP/HOA 的包封率为 （98.85±0.40）%。经HOA聚合物修饰后，脂质体的疏水性空间增大，对DOX具有较好的亲和力，因此，DOX/LP/HOA的包封率有所提高。

2.5 体外释放实验

采用动态透析法考察DOX/LP和DOX/LP/HOA脂质体的体外释放行为，结果见图5。脂质体释放初期均无明显的突释效应，表明DOX被全部包载于脂质体双层中，这与测定的较高包封率结果一致。随着时间的延长，脂质体均缓慢释放，DOX/LP和DOX/LP/HOA的72 h累计释放百分率分别为32.8%和23.16%，具有明显的缓释效果。此外，由图5可以看出，DOX/LP/HOA的释放更缓慢，这可能是因为HOA的疏水段十八烷基插入脂质体双分子层膜，导致疏水作用力增强，形成的空隙更小，不利于药物向外自由扩散。

图5DOX/LP/HOA和DOX/LP体外释放图（n=3）Fig.5 In vitro drug release profiles of DOX/LP/HOA and DOX/LP（n=3）

2.6 细胞毒性研究

MTT 法测定 的 游 离 DOX、DOX/LP、DOX/LP/HOA的细胞毒性见图6。结果表明，随着DOX质量浓度增加，不同组的MCF-7细胞存活率逐渐降低，这表明细胞毒性具有浓度依赖性。此外，DOX/LP、DOX/LP/HOA和游离DOX的细胞半数抑制质量浓度 （IC50） 分别为 （2.241±0.351）、（1.458±0.164）、（0.611±0.350） mg/L。 DOX/LP、DOX/LP/HOA、DOX的IC50依次变小，其抑制肿瘤细胞生长的活性越好，说明DOX的脂质体剂型（DOX/LP）更容易进入肿瘤细胞；用HA进一步修饰其脂质体剂型得到DOX/LP/HOA，DOX/LP/HOA可以通过CD44受体介导的内吞作用高效进入细胞，从而达到更好地抑制肿瘤细胞生长的活性。

图6DOX/LP、DOX/LP/HOA与游离DOX对 MCF-7细胞生长的抑制活性（n=3）Fig.6 In vitro cytotoxicity of DOX/LP、DOX/LP/HOA and free DOX against MCF-7 cells（n=3）

3 结语

脂质体作为药物载体因其主要由天然磷脂和胆固醇组成，具有良好的生物相容性，不会在体内积累，免疫原性小、无毒副作用等优点受到越来越多人的重视。并且，根据临床治疗的目的，可以改变脂质体的成分提高脂质体的靶向性。阿霉素是临床上常用的蒽环类抗恶性肿瘤药物，抗癌谱广，疗效好，但是其没有选择性，易导致骨髓抑制、胃肠道毒性以及心脏毒性等副作用，因此我们利用HA具有修饰方便、生物相容性以及受体靶向性等优点，制备了靶向性DOX/LP/HOA脂质体，增大对疏水性药物的携载能力，控制药物缓慢释放，提高药物对肿瘤细胞生长的抑制活性。