桦褐孔菌提取物抗乳腺癌活性部位筛选及成分分析

刘 鑫， 侯若琳， 许凯强， 李佳欢， 林文雄， 郑明锋， 傅俊生*

（1．福建农林大学 食品科学学院，福建 福州 350002；2．福建农林大学 生命科学学院，福建 福州 350002）

桦褐孔菌Inonotus obliquus属于担子菌门纤孔菌属Inonotus[1]，是一种寄生在白桦、榆树、银桦等树种上的白腐菌[2]。其主要分布于俄罗斯北部、北欧、日本北海道以及我国长白山和大兴安岭等北纬40~50°的地区[3]。它是一种药用真菌，广泛用于预防和治疗肝病、糖尿病、心脏病、胃病等疾病，且无明显的毒副作用[4]。随着国内外对桦褐孔菌的深入研究，发现桦褐孔菌提取物具有多种生物活性，主要有抗癌[5-7]、抗氧化[8-9]、增强免疫力[10-11]、降血糖[12]、抗病毒[13]和抗炎[14]，尤其是抗肿瘤方面表现出良好的活性。王文娟[15]等研究发现，桦褐孔菌水提醇沉物对人肝癌细胞的增殖抑制作用优于其他萃取物；Zhao[16]等研究发现，桦褐孔菌对宫颈癌HeLa细胞有明显的抑制增殖和诱导凋亡作用。

为了进一步寻找桦褐孔菌抗乳腺癌的活性部位，作者选取具有高转移能力的恶性乳腺癌MDAMB-231作为细胞模型，研究了桦褐孔菌提取物不同溶剂萃取部位抗乳腺癌活性，并采用LC-MS/MS初步分析其主要活性部位的化学成分，为开发利用桦褐孔菌食药用资源提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

人乳腺癌MDA-MB-231细胞：赛百慷生物技术股份有限公司；桦褐孔菌子实体：长白山保护开发区福生园参茸有限公司；石油醚、乙醇、乙酸乙酯、二甲基亚砜（DMSO）、正丁醇：国药集团化学试剂有限公司；胎牛血清（FBS）：杭州四季青生物工程有限公司；MTT：Sigma公司；RPMI-1640培养基：Gibco公司；其余试剂为分析纯。

1.2 仪器与设备

KH3200B型超声波清洗器：昆山禾创超声仪器有限公司；高速万能粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司；N-1000 v-W型旋转蒸发仪：瑞士Büchi公司；酶标仪：美国Bio-Rad公司；ST16 R型离心机：美国Thermo公司；MCO-15AC型CO2培养箱：日本三洋公司；XDS-3型倒置生物显微镜：意大利Optika公司；LTQ XL型 LC-MS/MS：美国 Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 提取与分离方法 桦褐孔菌干子实体置于烘箱干燥至恒质量，用粉碎机粉碎后过60目铁筛，得干粉。取20 g上述所得干粉于500 mL烧杯中，加入75%乙醇400 mL，70℃超声60 min，重复提取操作一次，合并提取液，抽滤，收集滤液，倒掉滤渣。减压浓缩滤液，旋转蒸瓶每次加液约瓶体积的1/3，压强0.09 MPa，温度37℃，回收乙醇得浸膏，浸膏质量4.8 g。以适量水重悬上述浸膏，浸膏依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取4次，合并萃取液并减压浓缩干燥，得石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位，操作流程见图1。以上4种干膏用DMSO促溶，DMSO体积分数小于0.1%。PBS配制成100 mg/mL的储存液，保存在4℃冰箱，避光保存，使用时配制成所需质量浓度。

1.3.2 细胞培养 MDA-MB-231细胞用含10%FBS的RPMI-1640培养液传代，在5%CO2、37℃条件下培养，实验用细胞均处于对数生长期。

1.3.3 MTT法[17]检测不同萃取部位抗乳腺癌活性将MDA-MB-231细胞的浓度调整到1×105个/mL接种于96孔板，每孔加细胞悬液200 μL，在37℃、5%CO2环境下培养24 h，待细胞贴壁，吸弃培养液，每孔加入180 μL新培养基，将其分成空白对照组（0 μg/mL）和给药组，每组平行设 4个重复；空白对照组加入20 μL不含药物的培养基，给药组依次加入桦褐孔菌提取物不同萃取部位药液20 μL，使其终质量浓度分别为 10、20、30、40、50、60、80、100 μg/mL，继续培养24 h后，吸除药液，每孔加5 mg/mL 的 MTT 20 μL，培养基 180 μL，培养 4 h 后，吸除 MTT，每孔加 150 μL DMSO， 振荡 15 min，570 nm下测光密度OD值。计算药物对肿瘤细胞的抑制率，对药效进行初步评价，并采用lgC-抑制率回归分析法计算半数抑制浓度（IC50）。

图1 实验操作流程Fig.1 Operation process of the experiment

1.3.4 活性部位对MDA-MB-231细胞生长的影响将MDA-MB-231细胞的浓度调整到1×105个/mL，接种于6孔板，每孔加2 mL细胞悬液，培养24 h，待细胞贴壁，吸弃培养液，加入药物（活性最强萃取部位）质量浓度为分别为20、40、80 μg/mL的细胞培养液2 mL，同时设置空白对照组 （0 μg/mL），于37℃培养箱中培养，在24 h时观察并记录细胞形态。

1.3.5 划痕试验[18]检测活性部位对MDA-MB-231细胞迁移力的影响 将MDA-MB-231细胞接种于6孔板内培养，待细胞基本长满，用200 μL枪头于细胞层中纵向划痕，造成培养细胞缺损区域带，加入一定浓度的含药（活性最强萃取部位）无血清培养基继续培养48 h，倒置显微镜下观察划痕处细胞的覆盖情况。

1.3.6 LC-M/MS初步分析 LC参数设定：色谱柱：Hypersil GOLD C18，100 mm×2.1 mm，5 μm；流动相：A：ACN B：0.1%甲酸水溶液； 流速：300 μL/min；进样量：10 μL；洗脱程序见表 1。

表1 LC梯度洗脱程序Table 1 LC gradient elution program

质谱参数设定见表2。

表2 质谱参数Table 2 MS parameters

1.3.7 统计学处理 数据用SPSS 13.0统计软件分析处理。统计描述：计量资料数据用x±s表示。两组间的均数比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 MTT法检测桦褐孔菌提取物各萃取部位抗乳腺癌活性

结果见表3和图2。药物作用24 h后，在一定质量浓度范围内，各萃取部位均可抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖，且呈一定的剂量依赖性；根据IC50的数据显示，药物对MDA-MB-231细胞的抑制作用大小依次为：石油醚部位>正丁醇部位>水部位>乙酸乙酯部位；其中乙酸乙酯部位在低质量浓度下对细胞的增殖有促进作用，随着质量浓度进一步的增大，则表现出抑制作用；石油醚萃取部位的抑制强度最大，其作用24 h的IC50值为76.17 μg/mL，因此选石油醚部位进行后续试验。

表3 MTT法检测桦褐孔菌提取物各萃取部位抗乳腺癌MDA-MB-231细胞活性（%，x±s，n=4）Table 3 Anti-breast cancer（MDA-MB-231） activity of different extraction parts

2.2 桦褐孔菌提取物石油醚部位对MDA-MB-231细胞生长的影响

上述结果显示，石油醚萃取部位相比其它萃取部位对肿瘤细胞表现出更强的抑制作用，因此选取该部位进一步探究其对细胞生长的影响。

形态观察结果见图3。由形态观察可知：空白对照组MDA-MB-231细胞生长正常，加药组随着石油醚部位药物的质量浓度升高，细胞形态发生明显的变化，细胞逐渐由梭形变成圆球形，并逐渐脱落，贴壁细胞数量减少，排列疏松，形态学上呈细胞凋亡状态[19]。

2.3 划痕试验检测桦褐孔菌提取物石油醚部位对MDA-MB-231细胞迁移的影响

划痕实验结果见图4。48 h时空白对照组划痕区变窄；加药组划痕区细胞的迁移速度减慢甚至停滞、细胞脱落。可见桦褐孔菌提取物石油醚萃取部位对MDA-MB-231细胞的迁移存在一定的抑制作用。

图3 不同质量浓度的药物对MDA-MB-231细胞凋亡的影响Fig.3 Effect of different concentration on the growth of MDA-MB-231 cells

图4 桦褐孔菌石油醚部位对细胞迁移的影响Fig.4 Effect of petroleum ether extract fractions on cell migration

2.4 LC-MS/MS对石油醚部位中可能存在的物质进行初步分析

为进一步探究石油醚活性部位其可能含有的化学成分，采用LC-MS/MS方法对该部位成分进行初步分析。经LC-MS/MS检测，桦褐孔菌石油醚萃取物中有14个离子强度较大的色谱峰被检测到，对这些峰的一级质谱测得精确相对分子质量计算分子式，结合二级质谱的分析以进一步解析该14个色谱峰的结构组成；使用Thermo ScientificTMMass FrontierTM7.0质谱解析软件对数据进行分析处理，推测对应分子可能的结构，分析数据见表4。

3 结 语

近年来，乳腺癌逐渐成为严重威胁人类健康的疾病，抗肿瘤药物的主要作用之一是有效的抑制肿瘤细胞的生长和增殖。桦褐孔菌作为食药用菌，具有抗肿瘤等作用，并且毒副作用小，因此研究其抗乳腺癌活性部位及成分为进一步开发利用桦褐孔菌资源具有重要的意义。

表4LC-MS/MS分析数据Table 4LC-MS/MS data

作者采用MTT法检测桦褐孔菌提取物各萃取部位抗乳腺癌MDA-MB-231细胞活性，结果显示桦褐孔菌石油醚萃取部位对MDA-MB-231细胞的抑制作用最强，作用24 h的IC50值为76.17 μg/mL，实验中桦褐孔菌提取物各萃取部位对MBA-MB-231细胞的抑制活性表现为：石油醚萃取部位>正丁醇萃取部位>水萃取部位>乙酸乙酯萃取部位；由细胞形态观察可知，随着石油醚部位药物的质量浓度升高，细胞形态发生明显的变化，并有诱导细胞凋亡的趋势；划痕试验结果表明桦褐孔菌提取物石油醚萃取部位对MDA-MB-231细胞的迁移存在一定的抑制作用。

实验运用LC-MS/MS技术，对桦褐孔菌石油醚萃取部位的化学组成进行了初步分析。在负离子模式中有14个离子强度较大的色谱峰下被检测到，经过Mass FrontierTM7.0软件解析和相关数据库的检索，14个化学成分被初步表征，其中的10种成分被初 步 鉴 定 ， 分 别 为 ：N1-（4-methoxy-1，2，5-thiadiazol-3-yl）sulfanilamide、氟苄烟酸、脯氨酸-苯丙 氨酸 、5，5-二 苯 基 海 因 、N-[p-[[（2-amino-4-hydroxy-6-pteridinyl）methyl]amino]benzoyl]glutamic acid、Pro-Hyp、没食子酸、金丝桃素、苦杏仁苷、胭脂红酸，这些化合物均首次从桦褐孔菌中得到鉴定。有研究报道金丝桃素对乳腺癌细胞有一定的抑制活性，而其它初步鉴定的化合物对乳腺癌细胞的抑制活性未见文献报道，关于何种成分发挥主要的抗乳腺癌活性还有待进一步研究。虽然其中4个物质虽没有初步鉴定，但亦对它们的相对分子质量及分子式进行了初步的表征。本研究采用的液质联用方法目的在于快速表征由多组分构成的复杂化学体系，能降低传统分离纯化过程中的盲目性，有利于提高活性化合物发现的概率，为进一步开发和利用桦褐孔菌药用资源提供科学的依据。