明永冰川低温细菌分离鉴定及生物学特性

赵晓曼， 周长涛， 魏云林， 季秀玲

（昆明理工大学 生命科学与技术学院，云南 昆明 650500）

地球表面生物圈中超过80%的区域温度均低于5℃，海洋的大部分区域其水温低于5℃[1]；而在南北两极平均温度仅为-1.8℃ ，绝大多数土壤的温度即使在夏季也不会超过10℃[2]。这些低温环境中生存着大量低温微生物，冷适应细菌在低温条件下的生存能力使得它们在生态学方面比嗜温菌更有优势[3]，冰川被认为是研究宇宙生命进化和地球环境演化等重大问题的“活化石”，同时也是一个多元化和动态的微生物“储藏库”。国内外冰川细菌研究方向主要为：新种的发现[4]、适冷机制[5]、固氮机制[6]和冰川细菌相关产物如抗冻蛋白、低温酶等[7]。可以说冰川微生物的研究只处于起始阶段，还有很长的路要走。然而据2010年世界冰川监测机构关于冰川融化的最新评估显示，冰川消融速度是2000年的2倍，冰川中独特而稀有的微生物菌种可能在未被人类初识前就因冰川消融濒危[8]。本研究对明永冰川低温微生物多样性的初步研究获得了一批重要的菌种资源，为寻找有应用价值的产低温酶菌株、了解该地区低温微生物多样性奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 培养基

LB固体培养基（g/L）：胰蛋白胨 10，酵母粉 5，NaCl 10，琼脂 20；pH 7.2。

LB液体培养基（g/L）：胰蛋白胨 10，酵母粉 5，NaCl 10；pH 7.2。

营养肉汁琼脂（g/L）：蛋白胨 5，牛肉膏 1，NaCl 5，琼脂 15；pH 7.0~7.2。

基础培养基（g/L）：葡萄糖 5，（NH4）SO42，柠檬酸钠 1，K2HPO4·3H2O 14，KH2PO46， 琼脂 20；pH 7.0。

1.2 样品采集和低温细菌的分离及形态学特征观察

1.2.1 样品采集和低温细菌的筛选与分离 本研究样品采样点位于云南省明永冰川 （N28°27′，E98°48′）。在实验室准备好固体培养基带到明永冰川。在明永冰川的冰舌地区采集冰、冰川退却地区土壤、融冰水、冰片和少量土壤尘埃混合样，共15份样品，每个平板均匀的铺洒约0.1 g样品后立即用封口膜密封。所有的样品在被运回实验室之前都置于4~8℃保存。回到实验室后，土样用土壤悬浮涂布法筛选分离：称取少量土样于灭菌三角瓶中，加入约100倍于土样质量的无菌水，取土壤稀释液涂布LB平板。水样、冰样直接平板划线，后均置于13℃培养一周，培养物经过三次划线分离纯化，并观察菌落形态。

1.2.2 运动性观察 在洁净载玻片上加一滴无菌水，挑取一环菌液与水混合，再加一环0.01%的美蓝水溶液与其混合均匀。用镊子取一洁净盖玻片，使其一边与菌液边缘接触，然后将盖玻片慢慢放下盖在菌液上，在显微镜下观察，发现两个细菌之间出现明显的位移的为阳性，否则为阴性。

1.3 菌株的生理生化特性研究

1.3.1 菌株生长温度范围 22株菌株使用4、15、25、37℃四个温度梯度，培养48 h后以未接种的新鲜培养基做阴性对照，然后测光吸收度OD600，重复3次。

1.3.2 抗生素抗性实验 接种10 μL新鲜培养的菌液于含不同质量浓度 （氨苄青霉素50 μg/mL；卡那霉素50 μg/mL；庆大霉素 7 μg/mL；四环素10 μg/mL）抗生素的5 mL LB液体培养基中，pH 7.0，于13℃、150 r/min培养36 h，观察菌株对抗生素的抗性。

1.3.3 对不同底物的分解能力 挑取单菌落接种于选择性橄榄油，干酪素和淀粉培养基上，于15℃培养48 h后观察降解情况。

1.3.4 氧化酶实验 用滤纸沾取菌落，滴一滴1%的对氨基二甲基苯胺盐酸盐，呈粉红色，再滴加一滴5%的α-奈酚溶液，若在30 s变成蓝色，为阳性反应，若在2 min内不变蓝色，则为阴性反应。

1.4 16S rRNA的PCR扩增

利用16S rRNA基因的一对通用引物进行PCR扩增。 引物：F 5′-AGAGTTTGATCCTGGTCAG-3′和R 5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′由英俊生物技术有限公司合成。PCR 反应体系（50 μL）：10×Ex-Taq buffer 5 μL ，2.5 mmol/l dNTP 3 μL， 模板 10 ng， 正向引物各 50 pmol，Ex-Taq DNA polymerase 0.2 μL，无菌水补足至 50 μL。 PCR 扩增程序：94 ℃变性 30 s，50 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 90 s，30个循环；72℃延伸10 min。

1.5 DNA序列测定和系统发育树的构建

DNA产物纯化后，与pMD19-T载体（Takara）16℃连接过夜，取10 μL连接产物转化感受态细胞DH5α。 以 M13（RV/M4）为引物（北京三博远志公司合成）检测转化产物。PCR扩增验证的产物由北京三博远志公司测序部进行双向测序，然后将所测序列提交 GenBank，通过 Blast（Ver2.2.14）进行序列同源性检索分析。选取同源性比较高的典型菌株的16S rRNA基因序列作为参比对象，然后用CLUSTAL X软件[9]进行多序列比对并计算供试菌株与参比菌株之间的序列相似性，采用邻位相接法 （Neighbor-Joining），应用MEGA 6.1软件构建系统进化树[9]。

2 结果与讨论

2.1 细菌分离纯化结果

作者分离纯化到500多株细菌，通过菌形态、颜色等选出22株细菌做进一步的研究，22株细菌编号、菌落及菌体形态特征见表1。

表1 菌株编号、菌落及菌体形态特征Table 1 Strains number，colony and cell morphology characteristics

2.2 菌株生理生化特性

22珠菌在4、15、25℃几乎均能生长，37℃时仅一株菌能生长，判定菌株MY14011属于嗜冷菌，其余21株菌属于耐冷菌；所有菌株均有氨苄青霉素抗性，对卡那霉素和四环素敏感，部分对庆大霉素敏感；22株菌均无淀粉酶和脂肪酶活性，多数菌株有蛋白酶水解活性；大部分菌株氧化酶反应呈阳性，见表2。

表2 22株细菌生理生化特性Table 2 Physiological and biochemical properties of 22 strains

2.3 分子鉴定结果

分离菌株PCR扩增出的16S rDNA片断条带单一，大小约为1 500 bp，连接pMD19-T载体，测序后提交 NCBI，通过 Blast（Ver2.2.14）比对进行分离菌株的初步鉴定。将所得菌株序列与GenBank中相关序列进行同源性检索分析，并选取同源性高的菌株利用ClustX和Mega软件构建系统发育树，见图1。

图1 22株菌与相关菌株的系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree of the 22 strains and their relatives

22株菌在进化树上分布在四个簇群中，其中菌株MY14011与Chromobacterium fluciative的同源性最高；菌株MY0504与Flavobacterium属的亲缘关系最近；菌株MY14015和MY1413与Arthrobacter属划分在同一簇群中；其余的18株菌株均归属于Pseudomonas属。

作者采用传统的微生物分离纯化法从明永冰川冰舌地区分离纯化获得22株可培细菌。根据16S rRNA基因序列分析、系统进化分析和部分生理生化特性结果表明：菌株MY0504与Flavobacterium pectinovorumDSM6368（AM230490）亲缘关系最近（97.6%），具有蛋白酶活性和氨苄抗性；菌株MY1413和 MY14015分别与Arthrobacter psychrophenolicusDSM1545T （AJ616763） 和Arthrobacter parietesLMG22281T（AJ639830）有很近的亲缘关系（98%），具有氨苄抗性；MY14011归属于色杆菌属，与河流色杆菌Chromobacterium fluviatile进化关系最近（97%），具有蛋白酶活性和氨苄抗性，可能为潜在新种，但需要进一步做分子杂交实验验证；其余18株菌均鉴定为假单胞菌属的菌株。

低温环境中细菌是数量和种类最多，目前从低温环境中分离得的微生物大多为耐冷菌，嗜冷菌所占比例较小，其中属于革兰氏阴性的Pseudomonas属和革兰氏阳性的Bacillus属较多[10]。和天山一号冰川类似[11]，在分离的22株菌种明永冰川假单胞菌属 （Pseudomonas）属于的优势菌株。黄杆菌属（Flavobacterium）广泛分布于土壤、淡水、海洋和极地环境中[12]，因其生长环境多样，具较高的蛋白酶活性，将为商品蛋白酶的开发利用提供有力的菌种资源库[7]。从2003年到2013年，周培谨和周宇光团队在中国1号冰川和海螺沟冰川分离出了Flavobacterium属的7个新种[13]。外籍华人Dechao Zhang从中国一号冰川分离到的Flavobacterium属的一个新种[14]。作者也从明永冰川分离到一株黄杆菌属（Flavobacterium）的菌株MY0504。迄今尚没有在冰川地区分离到Chromobacterium的相关报道，分析原因可能是，河流色杆菌是一种在亚热带和热带地区的水与土壤中存在的革兰氏阴性杆菌，明永冰川独特的低纬度热带季风气候和靠降水而生存的特点，使得能在冰川中分离到Chromobacterium属细菌，这为进一步研究冰川这一特殊区域的微生物与气候环境变化的关系提供了方向。

3 结语

研究明永冰川这一特殊生态环境下的低温微生物多样性，不仅有助于了解这一特殊地理条件及生态环境下的微生物群落演替规律，而且也对了解微生物―植被―土壤这一系统对全球气候变化的影响有极其重要的理论意义[15]。当下酶制剂产业发展前景广阔，对低温酶的开发和利用具有潜在的经济价值[16]。