牙鲆饲料中异亮氨酸与缬氨酸的交互作用对消化酶和部分免疫酶的影响

■王 旭 周 婧 薛晓强 刘 霞 陈明康 于海霞 姜志强 韩雨哲

(大连海洋大学农业农村部北方海水增养殖重点实验室辽宁省北方鱼类应用生物学与增养殖重点实验室，辽宁大连116023)

牙鲆（Paralichthys olivaceus）属鲽形目、鲆科、牙鲆属，是我国北方一种名贵的经济鱼类。许多研究表明鱼类的生长性能、饲料利用与饲料氨基酸的水平存在着密切的联系[1]。异亮氨酸与缬氨酸是水产动物体内不能合成必须从日粮中获得的氨基酸即必需氨基酸（EAA），均属于支链氨基酸（BCAA），具有调节蛋白质代谢，增强免疫力等重要生理功能[2]。目前对牙鲆关于支链氨基酸的研究多集中在对某一特定氨基酸需求量的研究[3]，关于氨基酸间交互作用对牙鲆消化酶和免疫酶的研究仅见近两年报道[4]。本文就饲料中添加异亮氨酸和缬氨酸产生的交互作用对牙鲆消化酶和免疫相关酶活力的影响进行研究，为研制牙鲆营养平衡的人工配合饲料提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验饲料

试验饲料以酪蛋白、明胶、鱼粉、混合氨基酸（包被材料为卡拉胶、羧甲基纤维素、ɑ-淀粉，分别占饲料2.5%、4.4%、14.8%）为主要蛋白源，鱼油、大豆卵磷脂为主要脂肪源制成基础饲料。设2个Ile水平（分别占干物质的0%和2%），并将其分别与3个Val水平(分别占干物质的0%、0.83%和2.27%)交互制成6种试验饲料分别为：低水平的Ile与低水平的Val(LI-LV组)、中水平的Val（LI-MV组）、高水平的Val（LI-HV组）相组合，高水平的Ile与低水平的Val（HI-LV组)、中水平的Val（HI-MV组）、高水平的Val（HI-HV组）相组合。在饲料中添加晶体氨基酸混合物的最适氨基酸比例[5-6]，以全鱼蛋白氨基酸组成为参考，并参考已知牙鲆的氨基酸的需求[6-7]的研究而配制（见表1）。由于晶体氨基酸易溶于水，为了防止浸出损失，将晶体氨基酸进行预包被[7]。将包被氨基酸与其他饲料原料搅拌均匀后，用小型饲料制粒机（常州品正干燥设备有限公司）将饲料制成两种规格（粒径为1.4 mm和3.5 mm）的饲料，饲料在40℃烘箱下烘至水分为18%并储存至-20℃冰箱中保存备用。基础饲料配方见表2，试验饲料的营养成分含量及氨基酸组成见表3。

表1 CAA混合物的含量（g/100 g，干重）

1.2 饲养管理

试验用鱼购自大连天正实业有限公司，鱼苗先在大连海洋大学农业部北方海水增养殖重点试验室水槽（1 000 L）中暂养2周以适应试验室环境，驯化期间投喂对照组饲料。暂养结束后挑选体格健壮、外观正常、大小均一的试验鱼进行分组。每个水槽放入初始体重为(3.57±0.05)g的试验鱼20尾。一共6个处理，每个处理做3个平行，共需要18个水槽。将试验鱼放入200 L的蓝色圆槽中进行饲养，本试验为流水养殖，水流速为0.9 L/min，自然海水经沙滤后使用。每天上午8点和下午5点进行两次投喂，投喂至表观饱食。每次投喂后1 h收集残饵并同时清理粪便，每天对试验鱼进行12 h光照12 h黑暗处理。24 h连续充气，每天测定水温（n=60）、pH值和盐度，试验期间水温为(24.3±0.8)℃，pH值和盐度为分别为(7.8±0.2)和(31.9±0.2)，试验周期为60 d。

表2 基础饲料配方（%干物质）

1.3 样品采集

饲养试验结束后，禁食24 h。每桶鱼随机选取8尾鱼，分别称取每条鱼的体重，在冰浴上用消毒过的解剖工具进行解剖，分别取鱼的肝脏和中肠置于离心管后放入液氮中速冻，然后转移至-80℃冰箱中保存。用于测定肝脏组织免疫酶和抗氧化酶及肠道消化酶的测定。

1.4 样品测定指标与方法

准确称取组织样品，在4℃冰箱缓溶，肝脏按质量体积比1∶9（w/v）的比例加入0.9%的生理盐水，肠道的质量体积比为1∶4(w/v)加入生理盐水制成组织匀浆。在10 ml的匀浆器中研磨成匀浆液，匀浆液以2 500 r/min离心10 min，取上清液保存在-80℃冰箱备用。肝脏抗氧化酶：总抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）；肝脏免疫酶：碱性磷酸酶（AKP）；肠道消化酶：蛋白酶（protease）、淀粉酶（amylase）、脂肪酶（lipase）均使用南京建成生物有限公司试剂盒测定。

1.5 数据处理

试验数据用“平均值±标准误”表示，使用SPSS19.0软件进行双因素方差分析，得到异亮氨酸与缬氨酸的交互作用的显著性（即2个水平的异亮氨酸×3个水平的缬氨酸），若交互作用显著则进行单因素（One-way ANOVA）方差分析，并采用Tukey进行多重比较法对数据进行处理，显著水平为P＜0.05。

表3 试验饲料的营养成分含量及氨基酸组成

2 结果

2.1 饲料中异亮氨酸与缬氨酸不同水平的添加量对

牙鲆肝脏抗氧化酶和免疫酶活力的影响(见表4)

由表4可知，总抗氧化（T-AOC）与超氧化物歧化酶（SOD）对不同水平的异亮氨酸与缬氨酸有极显著的交互作用（P＜0.01），T-AOC与SOD的酶活力在低异亮氨酸水平时均随缬氨酸水平的升高而降低，而在高异亮氨酸水平时T-AOC酶活力随缬氨酸水平的增高先降低而后升高，最高酶活力为LI-LV组显著高于除LI-MV组外其他组，SOD则随缬氨酸水平的升高而升高且HI-HV组的酶活力最高。而过氧化氢酶（CAT）在低异亮氨基酸组随着缬氨酸增高先升高而后降低，即LI-MV组活力最高且显著高于其他组，在高异亮氨基酸组则相反。

表4 饲料中不同水平的异亮氨酸与缬氨酸对牙鲆肝脏抗氧化酶和免疫相关活力的影响

碱性磷酸酶（AKP）对不同水平的异亮氨酸与缬氨酸有交互作用（P＜0.05），低异亮氨酸水平时随缬氨酸的增高先降低而后升高，在高异亮氨酸水平时则逐渐升高。

2.2 饲料中异亮氨酸与缬氨酸不同水平的添加量对牙鲆消化酶活力的影响(见表5)

表5 饲料中异亮氨酸与缬氨酸不同水平的添加量对牙鲆肠道消化酶活力的影响（U/mg prot.）

试验结果表明，异亮氨酸与缬氨酸对牙鲆肠道消化酶活力有极显著交互作用（P＜0.01）。在低异亮氨酸水平时肠道蛋白酶，随缬氨酸的升高呈现出先增高而后降低的趋势，在LI-MV水平时酶活力达到最高值，且显著高于其他组。淀粉酶在HI-LV组活力最高，随缬氨酸水平的增高反而会降低酶活力。脂肪酶在高异亮氨酸水平与低缬氨酸水平交互时其酶活最低，而后随缬氨酸水平的增高脂肪酶活力则是逐渐增高，且在高水平异亮氨酸与高水平缬氨酸交互时脂肪酶活力最高。

3 讨论

3.1 饲料中不同水平的异亮氨酸与缬氨酸对牙鲆肝脏抗氧化酶和免疫酶活力的影响

超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)和过氧化氢酶(catalase,CAT)在生物机体免受损伤方面发挥重要作用，是生物机体内主要清除机体自由基的抗氧化酶，从而维持细胞和机体正常的生理活动[3]。本试验结果表明异亮氨酸与缬氨酸有显著的交互作用，且显著影响牙鲆肝脏T-AOC、SOD和CAT的活力。抗氧化酶在低异亮氨酸水平时随缬氨酸含量的增高抗氧化酶活力反而会降低（除CAT的LI-MV组外），这表明在低异亮氨酸水平时缬氨酸对抗氧化酶颉颃作用。在高异亮氨酸水平时SOD活力与缬氨酸水平成正相关，其HI-HV组活力最高。这表明不同水平的Ile与Val对牙鲆抗氧化酶活力有明显的交互作用，且适宜水平异亮氨酸与缬氨酸可显著提高牙鲆肝脏抗氧化酶活性等非特异性免疫功能。这与异亮氨酸在吉富罗非鱼与建鲤等水产动物研究结果相似[8-9]。这可能由于Ile水平能够改善Leu（生酮氨基酸）与Ile（生糖兼生酮氨基酸）、Val（生糖氨基酸）3种支链氨基酸的平衡关系，当异亮氨酸不足时，打破支链氨基酸间的平衡，限制了同为支链氨基酸的缬氨酸的利用，进而影响牙鲆体内酶的代谢，使SOD酶活力降低。相反在高异亮氨酸水平时随缬氨酸水平的增高使机体内的支链氨基酸逐渐达到平衡，进而促进蛋白质合成和抑制其分解的效果，并在一定程度上提高机体免疫力及SOD酶活力。

碱性磷酸酶（AKP）是一种通过寡糖磷脂酰肌醇锚定在细胞膜上的结合蛋白，在生物体可直接参与磷酸基团的转移和代谢的生理过程，且参与体内的钙、磷代谢，维持体内适宜的钙磷比例[10]。根据本试验研究结果发现Ile与Val在一定程度可影响牙鲆肝脏AKP活力，AKP在低异亮氨酸水平时其活力随缬氨酸水平的增高先降低而后升高，在高异亮氨酸水平时则逐渐升高，且在HI-HV组酶活性最高。说明饲料中不同水平的异亮氨酸和缬氨酸显著影响牙鲆AKP酶活力，在适宜水平时显著提高AKP酶活性。这与孙玉轩[8]和武文一[11]在饲料中分别添加不同水平的异亮氨酸和缬氨酸对吉富罗非鱼消化酶和免疫酶活力研究结果一致。试验结果表明异亮氨酸与缬氨酸对牙鲆肝脏AKP存在显著交互作用，且高水平的异亮氨酸与高水平的缬氨酸可起协同增强作用，使牙鲆肝脏AKP酶活性达到最大。当异亮氨酸与缬氨酸在HI-HV水平时使支链氨基酸间达到平衡，促进了机体的免疫细胞和体内酶的分泌，从而提高牙鲆机体的免疫力。

3.2 饲料中不同水平的异亮氨酸与缬氨酸对牙鲆肠道消化酶活力的影响

鱼类的生长以及消化能力与肠道消化酶活力关系密切，酶活越高越有助于消化[12]，从而可促进鱼类的生长。黄忠等[13]研究表明饲料中适宜水平的异亮氨酸可显著提高卵形鲳鲹肠淀粉酶和胃蛋白酶的活性；Luo等[14]研究发现，适宜的缬氨酸水平可以促进草鱼显著提高的蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的活性；王莉苹[15]发现亮氨酸与异亮氨酸的交互作用可显著影响牙鲆肠道消化酶活力。本试验研究结果发现异亮氨酸与缬氨酸对牙鲆肠道消化酶有极显著交互作用（P＜0.01），在低异亮氨酸水平与高水平的缬氨酸交互作用时可显著降低肠道消化酶活力。这是因为Ile与Val缺乏或过量造成的饲料氨基酸不平衡从而会显著抑制牙鲆消化酶的活性。而肠道蛋白酶活力在低异亮氨酸水平时随缬氨酸水平的增高先增高而后降低且在IL-MV组时酶活力达到最高值，在高异亮氨酸水平时则无组间差异性，这可能是因为当Ile含量过量或不足时，缬氨酸在蛋白质合成中发挥很重要的功能，适宜的缬氨酸含量能够影响鱼类肠道微生物菌群的平衡，从而提高肠道消化酶的活力[16]。在高异亮氨基酸水平时脂肪酶则随缬氨酸水平的增高而逐渐增高，其中HI-HV组活力最高（P＜0.05）。这可能是因为高水平的Ile和Val促进了BCAA之间的平衡，BCAA可为谷氨酸及谷酰胺的合成提供氮源和碳源，为促进脂肪酶的分泌[17]，提供了碳源和氮源[18]，但这两种氨基酸的交互作用对鱼类机体内免疫代谢机制的具体影响，仍有待深入研究。

4 结论

①异亮氨酸与缬氨酸对牙鲆体组织消化酶和免疫酶有显著交互作用，可显著影响牙鲆肠道消化酶和肝脏免疫相关酶的活性。②在Ile 2%与Val 2.27%交互作用时牙鲆脂肪酶、超氧化物歧化酶、碱性磷酸酶酶活力均达到最高值。这表明高水平的异亮氨酸（2%）与高水平缬氨酸（2.27%）可起协同增强作用，提高牙鲆肝脏免疫酶活性和肠道消化酶活性。