同位素稀释液相色谱串联质谱法测定饲料中T-2和HT-2毒素含量

■蔡小明

（福建省产品质量检验研究院国家加工食品质量监督检验中心，福建福州350002）

T-2、HT-2毒素是由多种镰刀菌产生的一类霉菌毒素，广泛分布于自然界，主要存在于大麦、小麦、燕麦、玉米等谷物及其饲料制品，是一类常见的污染田间作物和库存谷物的毒素，也是目前报道的A类单端孢霉烯族毒素中毒性最强的真菌毒素，动物长期服用后易导致严重疾病甚至死亡[1-3]。欧盟在2006年就要求对T-2、HT-2毒素危害信息的收集、研究及检测方法开发，并建议对T-2、HT-2毒素的污染情况进行监控。2017年8月欧盟食品安全局（ESFA）发布了T-2毒素与HT-2毒素的膳食暴露风险，最大暴露量介于 0.12～0.16 μg/kg体重每天与2.37～2.58 μg/kg体重每天[4]。

目前，T-2、HT-2毒素检测方法研究主要针对的是食品类产品，而对饲料方面的研究较少。T-2、HT-2毒素测定方法主要有酶联法、液相法、气质法及液质法[5-8]，酶联法检测容易产生假阳性，液相法及气质法检测需要对样品进行衍生，步骤繁琐且衍生剂毒性较大，相比之下液相色谱串联质谱法具有更简便、灵敏度更高的优势被广泛用于T-2、HT-2毒素检测。

本研究旨在采用同位素稀释液相色谱串联质谱法，建立饲料中T-2、HT-2毒素的检测方法，为饲料中T-2、HT-2毒素的监管和企业的自检提供技术支撑。

1 试验部分

1.1 主要仪器和试剂

Agilent 6490高效液相色谱仪配串联四极杆质谱仪（美国Agilent公司）；Milli-Q超纯水纯化系统（美国Millipore公司）；BT 224 S分析天平（德国赛多利斯公司）；DS-8510 DTH超声波振荡器（上海生析超声仪器有限公司）；XH-B旋涡混均器（江苏康健医疗用品有限公司）；0.2 μm聚四氟乙烯（PTFE）滤膜（美国ASC）。

T-2、HT-2毒素及其内标，购于奥地利Romer公司；免疫亲和柱（T-2/HT-2 Star™ R美国Romer）；试验用水为Milli-Q超纯水；其余试剂均为色谱纯。

1.2 色谱与质谱条件

色谱柱：HSS T-3（1.7 μm，2.1 mm Í100 mm）；流动相：10 mmol/l乙酸铵（含0.1%甲酸）-乙腈梯度；流速0.3 ml/min；柱温：40 ℃；进样量2 μl。

流动相梯度洗脱程序见表1。

表1 液相色谱梯度洗脱程序（%）

离子源：电喷雾离子源(ESI)；扫描方式：正离子模式（SEI+），多反应监测（MRM）；脱溶剂气温度：200℃；脱溶剂气流速15 L/min;鞘气温度300℃；鞘气流速 12 L/min；毛细管电压：3.5 KV；T-2和HT-2毒素及其内标的母离子、子离子及碰撞能量等质谱分析参数见表2。

表2 T-2、HT-2毒素质谱测定条件

1.3 标准溶液的配制

1.3.1 混合储备液的配制

准确移取T-2、HT-2毒素液体标准品（浓度均为 100 μg/ml）1.0 ml乙腈定容至 100 ml，配制成浓度为1.00 μg/ml的标准储备液，保存于4℃冰箱中。

1.3.2 基质匹配标准工作曲线的配制

分别吸取一定量的混标标准储备液并加入内标，添加样品空白提取液，氮气吹干后，用流动相稀释成浓度为1.0～200 ng/ml的混合标准系列工作液，临用新配。

1.4 样品前处理

称取5.00 g（精确至0.01 g）均匀样品，置于50 ml聚丙烯离心管中，加入20 μl内标和20.0 ml 80%乙腈，振摇混匀，置于超声波振荡器中提取30 min，于4℃12 000 r/min离心5 min，将上清液转移至另一离心管中。

移取4.0 ml上清液，用40 ml PBS缓冲液稀释后，过免疫亲和柱，控制流速1～2 ml/min，用10 ml PBS缓冲液淋洗小柱，真空抽干，用5.0 ml甲醇以1～2 ml/min流速洗脱并收集，置于40℃水浴中氮吹近干，再用20%乙腈水溶液定容到1.0 ml，混匀，用0.2 μm聚四氟乙烯（PTFE）滤膜过滤后检测。

2 结果与讨论

2.1 仪器条件优化

根据目标物的结构，采用正离子模式，T-2毒素母离子（m/z）为489.3，HT-2毒素母离子（m/z）为447.1，优化相关质谱参数选择T-2毒素的定量/定性离子（m/z）对为：387.1/245.2，HT-2毒素的定量/定性离子（m/z）对为：345/284.9。试验表明，流动相中加入甲酸可以增强目标物的离子化效率，而加入乙酸铵可以改善目标物的峰形，最终确定以乙腈-10 mmol/l乙酸铵（含0.1%甲酸）作为流动相，总离子流图如图1。

图1 T-2、HT-2毒素的总离子流图

2.2 提取溶剂的选择

采用加标回收方式对比了不同乙腈水比例溶液（体积比100∶0、90∶10、80∶20、70∶30、50∶50）对T-2、HT-2毒素回收率的影响，平行试验三次。结果表明：随着提取液中水含量的升高，T-2、HT-2毒素的回收率也随之增大，当提取溶剂中水含量达到20%（乙腈水80∶20）时，T-2、HT-2毒素回收率在81.1%～95%之间，当水的含量超过20%时，回收率基本不变，且提取液中明显浑浊。因此，选择乙腈水体积比80∶20作为提取溶剂。

2.3 线性范围和检测限

在1.0～200.0 ng/ml范围内配制六个不同浓度的标准溶液进行试验，以浓度为横坐标，峰面积与各自内标峰面积比值为纵坐标，绘制工作曲线，见表3，T-2、HT-2毒素线性关系较好（R2＞0.999）。以3倍信噪比计算检出限（LOD）、10倍信噪比计算定量限(LOQ)，T-2、HT-2毒素的检出限均为1.0 μg/kg，定量限均为3.0 μg/kg，满足痕量分析要求。

表3 线性方程、线性参数及线性范围

2.4 精密度与准确度

以阴性饲料样品作为基质，进行10、50、200 μg/kg三水平加标回收试验，每种水平平行试验6次（n=6），结果见表4，T-2、HT-2毒素平均回收率在81.5%～105.8%之间，相对标准偏差（RSD）在1.1%～2.8%之间，满足方法学要求。

表4 T-2、HT-2毒素回收率与精密度（n=6）

2.5 实际样品检测

随机购买市售16份不同类型饲料测定其T-2、HT-2毒素含量，有四份样品饲料检出T-2含量在21～218 μg/kg，其中一份样品同时检出HT-2毒素含量为42 μg/kg，说明所建立方法适用于饲料中T-2、HT-2毒素的检测。

3 结语

本文建立了饲料中T-2毒素和HT-2毒素含量的同位素稀释液相色谱质谱的测定方法，该方法操作简单、准确、检测限低、重现性好，适用于饲料中T-2、HT-2毒素的检测。