松香含氮衍生物对小地老虎四龄幼虫的拒食活性及构效关系

翟兆兰， 闫鑫焱， 许 吉， 宋湛谦， 商士斌， 饶小平,3*

(1. 中国林业科学研究院 林产化学工业研究所；生物质化学利用国家工程实验室；国家林业局 林产化学工程重点开放性实验室；江苏省 生物质能源与材料重点实验室， 江苏 南京 210042； 2. 南京林业大学 林业资源高效加工利用协同创新中心， 江苏 南京 210037； 3. 中国林业科学研究院 林业新技术研究所， 北京 100091)

小地老虎(Agrotisypsilon)，别称地蚕、切根虫、地剪，属鳞翅目夜蛾科，分布广泛，食性杂，且食量大。3龄后的小地老虎剪苗率高，会对农作物产生重大危害[1]。目前，对小地老虎的防治方法主要是化学农药防治，然而杀虫剂长期大量使用，不仅会使害虫产生抗药性而且会引发严重的环境污染和农产品安全问题，从而危及人类和动物的健康[2-3]。随着绿色环保理念的推广，基于农业可持续发展和生态环境保护对无公害农药的迫切需求，人们不断探索更加安全环保的害虫防治药剂与方法[4-5]。昆虫拒食剂主要通过干扰昆虫的取食行为从而达到作物保护的目的，不会直接杀灭昆虫，具有使用安全、对环境友好、不易产生抗药性等优点，因而受到了广泛的关注[5-8]。经过改性的天然资源产物中的次生物质是昆虫拒食剂的主要来源，例如萜类、生物碱、酚类、醌类、香豆素类、糖类等不同类型的化合物[8-10]。松香是我国特有的可再生林业资源，其主要成分树脂酸具有独特的三环二萜结构，含有双键和羧基2种官能团，易于化学修饰。以松香为原料的产品丰富，广泛应用于国民生活的各个领域[11-13]。此外松香树脂酸及其衍生物具有广泛的生物活性，可用于生产具有抑菌、杀虫、抗肿瘤及抗病毒等生物活性的产品[10, 14-17]。近年来研究发现松香衍生物具有较好的拒食活性，Klejdysz等[18]合成的松香酸离子液体对鲎虫、赤拟谷盗虫和谷斑皮蠹等农作物害虫具有较强的拒食效果。本课题组前期研究发现，松香酯类及酰胺类衍生物对粘虫、蚜虫等农作物害虫表现出较强的拒食活性[19-20]。本研究探索了4种不同类型的松香含氮衍生物(脱氢枞酸酰胺、脱氢枞胺(取代)苯甲醛Schiff碱、脱氢枞酸酰基硫脲和二氢枞酸酰基硫脲)对小地老虎4龄幼虫的拒食活性，以期筛选出具有高拒食活性的松香衍生物，为今后小地老虎的防治提供安全、环保的药剂。

1 实 验

1.1样品

脱氢枞酸酰胺衍生物(1a～1i)、脱氢枞胺(取代)苯甲醛Schiff碱衍生物(2a～2j)、脱氢枞酸酰基硫脲衍生物(3a～3e)和二氢枞酸酰基硫脲衍生物(4a～4h)根据文献[21～22]的方法合成及提纯，其结构式如图1所示。所得样品用乙醇或丙酮配成10 g/L的母液，在-20 ℃下保存备用，试验前母液用质量分数0.1%吐温-80的水溶液稀释。

1.2供试靶标及培养条件

小地老虎(Agrotisypsilon)在室温为(25±1) ℃，相对湿度为(75±5)%和光照周期光照16 h、黑暗8 h(L16∶D8,h∶h,下同)的室内继代人工饲养。选择个体大小一致的小地老虎4龄幼虫供试。甘蓝叶取自温室人工栽培的甘蓝，未接触任何化学药剂。

1.3松香含氮衍生物对小地老虎4龄幼虫的拒食率测定

采用浸叶法进行拒食活性的测定。将新鲜甘蓝叶片用清水洗净、自然晾干，用打孔器制备直径2.0 cm、面积314 mm2的叶碟，将其放入1.0 g/L的药液中浸泡10 s，以质量分数0.1%吐温-80的水溶液作参照，自然晾干，放入12孔养虫板中，每孔放入1片叶碟，接入饥饿处理4 h且生长一致的小地老虎4龄幼虫，每种处理重复10次。之后，将养虫板放置于温度为(27±1) ℃、相对湿度为(75±5)%、光照周期为L16∶D8的环境中饲养幼虫，24 h后取出残存的叶碟，用1 mm × 1 mm标准方格纸测量叶碟的剩余面积计算拒食率。拒食率(%) =(对照组取食面积-处理组取食面积)/对照组取食面积×100%。

1.4松香含氮衍生物对小地老虎4龄幼虫的拒食中浓度测定

将样品母液用质量分数0.1%吐温-80的水溶液稀释配制成3～4个系列浓度，按照1.3节中的方法计算不同浓度的拒食率，拒食中浓度(AFC50)的计算方法参照文献[23]中的方法，将拒食率设为概率值y、松香含氮衍生物的浓度设成变量x，应用DPS v7.05软件模拟得到毒力回归方程y=ax+b，并用该方程计算拒食率为50%时的样品浓度，即AFC50。

图1 松香含氮衍生物的分子结构Fig. 1 The molecular structure of rosin nitrogen derivatives

2 结果与讨论

2.1松香含氮衍生物对小地老虎4龄幼虫的拒食率

松香含氮衍生物对小地老虎4龄幼虫拒食活性的10组实验取平均值得到取食面积，进一步计算拒食率，结果见表1。试验中发现质量浓度为1.0 g/L的松香含氮衍生物对小地老虎4龄幼虫无致死作用。由表1可以看出脱氢枞酸酰胺衍生物及脱氢枞酸酰基硫脲衍生物对小地老虎4龄幼虫的拒食率均低于23%，对小地老虎4龄幼虫无明显拒食作用。脱氢枞胺对氯水杨醛Schiff碱(2i)处理过的甘蓝叶小地老虎的取食面积大大减少，在质量浓度1.0 g/L时的拒食率为86.12%，较大地抑制了小地老虎4龄幼虫的取食；脱氢枞胺对甲氧基苯甲醛Schiff碱(2b)对小地老虎4龄幼虫的拒食率为52.04%，具有较强的拒食活性；其他脱氢枞胺(取代)苯甲醛Schiff碱衍生物的拒食率低于22%，未表现出对小地老虎4龄幼虫的拒食活性；并且2a、2d和2j对小地老虎4龄幼虫的取食表现出促进作用。二氢枞酸异丙醇酰基硫脲(4b)的拒食率为85.13%，较大地抑制了小地老虎4龄幼虫的取食；二氢枞酸2-羟甲基-1,3-丙二醇酰基硫脲(4c)和二氢枞酸呋喃酰基硫脲(4g)的拒食率分别为66.70%和50.48%，表现出对小地老虎4龄幼虫较强的拒食作用，其他二氢枞酸酰基硫脲衍生物对小地老虎4龄幼虫的取食无明显抑制作用，拒食率均小于22%。

表1 松香含氮衍生物对小地老虎4龄幼虫的取食面积及拒食率

2.2松香含氮衍生物对小地老虎4龄幼虫的拒食中浓度

由2.1节的结果可知脱氢枞胺(取代)苯甲醛Schiff碱衍生物2b和2i，二氢枞酸酰基硫脲衍生物4b、4c和4g对小地老虎4龄幼虫表现出较强的拒食作用，因此继续测定了上述5种松香含氮衍生物在不同质量浓度下对小地老虎4龄幼虫的取食面积和拒食率，结果列于表2。并由不同质量浓度下的拒食率，应用毒力回归方程计算拒食率为50%时的样品质量浓度，即拒食中浓度(AFC50)，相关结果列于表3。

表2 不同质量浓度的松香含氮衍生物(2b、 2i、 4b、 4c和4g)对小地老虎4龄幼虫的取食面积及拒食率

表3 松香含氮衍生物(2b、 2i、 4b、 4c和4g)对小地老虎的拒食中质量浓度(AFC50)

由表2可得，5种松香含氮衍生物对小地老虎4龄幼虫的拒食活性随浓度的降低而降低。脱氢枞胺(取代)苯甲醛Schiff碱衍生物2i在质量浓度0.001 g/L时的拒食率为14.98%，仍具有一定的拒食活性，并且2i的AFC50值极低为0.04 g/L，其值远小于脱氢枞胺(取代)苯甲醛Schiff碱衍生物2b的AFC50(0.66 g/L)。二氢枞酸酰基硫脲衍生物4b同样具有较低的拒食中浓度，为0.25 g/L；4c和4g的拒食中浓度分别为1.47和0.69 g/L。二氢枞酸酰基硫脲衍生物对小地老虎4龄幼虫的拒食活性顺序为4b>4g>4c。对照物梣酮对小地老虎2龄幼虫24 h的拒食率为42.8%，拒食中质量浓度为13.40 g/L[24]，松香含氮衍生物2i、2b、4b、4g和4c的拒食中浓度均低于梣酮对小地老虎的拒食中浓度，说明松香含氮衍生物2i、2b、4b、4g和4c对小地老虎均具有较好的拒食活性。

2.3松香含氮衍生物的结构与其拒食活性的构效关系

对比4类松香含氮衍生物对小地老虎4龄幼虫的拒食活性，脱氢枞胺(取代)苯甲醛Schiff碱和二氢枞酸酰基硫脲对小地老虎4龄幼虫的拒食活性较高，脱氢枞酸酰胺和脱氢枞酸酰基硫脲对小地老虎4龄幼虫的拒食活性较弱。

对比10种不同的脱氢枞胺(取代)苯甲醛Schiff碱对小地老虎4龄幼虫的拒食活性，化合物2b远大于2a，由图1中的结构式可以看出，化合物2b与2a相比仅多一个甲氧基，说明甲氧基的引入大大提高了脱氢枞胺(取代)苯甲醛Schiff碱对小地老虎4龄幼虫的拒食活性；2c和2g的拒食活性也大于2a，并且2c和2g的拒食活性相近，表明氯原子和羟基的引入增强了脱氢枞胺(取代)苯甲醛Schiff碱对小地老虎4龄幼虫的拒食活性，并且氯原子和羟基的效果相近，将氯原子和羟基同时引入到脱氢枞胺(取代)苯甲醛Schiff碱中得到2i，大大增强了对小地老虎的拒食活性，质量浓度1 g/L时，2i对小地老虎4龄幼虫的拒食率为86.12%。2d、2e和2f的拒食活性与2a相近，说明虽然氟原子与氯原子同为卤素原子，但氟原子对脱氢枞胺(取代)苯甲醛Schiff碱对小地老虎4龄幼虫的拒食活性无明显影响。甲氧基、氯原子和羟基对脱氢枞胺(取代)苯甲醛Schiff碱对小地老虎4龄幼虫的拒食活性具有明显的增强作用，氯原子和羟基的同时引入更能大大提高其拒食活性。由8种二氢枞酸酰基硫脲衍生物对小地老虎4龄幼虫拒食活性可以看出，4b和4c的拒食活性远大于4a，即羟基位置和个数的改变对二氢枞酸酰基硫脲衍生物对小地老虎4龄幼虫的拒食活性有明显的影响。4h的拒食活性大于4d，表明氟原子比甲基更能增强二氢枞酸酰基硫脲衍生物对小地老虎4龄幼虫的拒食活性。4g远大于4e和4f，说明含有呋喃环的二氢枞酸酰基硫脲衍生物的拒食活性比含有吗啉环和哌嗪环的好。

3 结 论

3.1研究了4种不同类型的松香含氮衍生物对小地老虎4龄幼虫的拒食活性，筛选出5种具有较高拒食活性的松香含氮衍生物。其中2i和4b几乎能完全抑制小地老虎4龄幼虫的取食，质量浓度1 g/L时2i和4b24 h后的拒食率分别为86.12%和85.13%；2b、4c和4g的拒食率大于50%，对小地老虎4龄幼虫同样具有较强的拒食活性。2i具有极低的拒食中质量浓度 (AFC50)为0.04 g/L，2b、4b、4c和4g的AFC50分别为0.66、 0.25、 1.47和0.69 g/L。

3.2脱氢枞酸酰胺衍生物和脱氢枞酸酰基硫脲衍生物对小地老虎的拒食活性较弱且其结构变化对小地老虎4龄幼虫的拒食活性的影响较小。脱氢枞胺(取代)苯甲醛Schiff碱衍生物和二氢枞酸酰基硫脲衍生物对小地老虎4龄幼虫的拒食活性较高，研究发现甲氧基、氯原子和羟基对脱氢枞胺(取代)苯甲醛Schiff碱的拒食活性有明显的增强作用；二氢枞酸酰基硫脲衍生物中羟基的位置和个数对小地老虎4龄幼虫的拒食活性有明显的影响。