DNJ双层渗透泵片的制备及比格犬体内药动学研究

孙照英， 聂彦彦， 赵华南， 刘志明*

(1. 东北林业大学 材料科学与工程学院， 黑龙江 哈尔滨 150040； 2. 青岛海慈医疗集团， 山东 青岛 266100； 3. 哈药集团技术中心， 黑龙江 哈尔滨 150020)

1-脱氧野尻霉素(DNJ)为桑叶的提取物，是一种强力降血糖物质，可用于治疗糖尿病[1]。1-脱氧野尻霉素进入体内后存在释放不平稳的特点，导致血糖过度降低而出现不良反应，因此患者依从性差[2-3]。而普通制剂存在给药频繁、血药浓度波动大、不方便患者长期服用等缺点，只有研发出能持续平稳的降血糖药物才能适应目前的临床需要。渗透泵控释制剂是以零级恒速释药为基本特征，以膜内外的渗透压差为释药动力的一种新型制剂。渗透泵片释药行为不受环境pH值、胃肠蠕动等因素影响，可最大限度地避免或减少血药浓度波动，提高药物制剂的安全性和有效性，可减少服药次数，提高患者的依从性，可避免普通制剂存在的不足，并且开发周期短，经济效益好[4-9]。本研究将DNJ制备成双层渗透泵片制剂，优化处方后进行了比格犬体内药动学研究，以期为临床用药提供理论依据。

1 实 验

1.1原料、试剂与仪器

1-脱氧野尻霉素(DNJ)原料药、DNJ速释片(40 mg)，哈药集团制药总厂；DNJ对照品(纯度99.2%)，中检所；聚氧乙烯(PEO)，上海昌为医药辅料技术有限公司；羟丙基甲基纤维素(HPMC)E50、聚乙二醇(PEG)4000、氯化钠和滑石粉，均购于安徽山河辅料有限公司。醋酸纤维素(CA)、乙醇、甲醇、乙腈、醋酸铵、乙醚、二氯甲烷，均为市售分析纯试剂。

TDP型单冲压片机，上海第一制药机械厂；WBF5包衣锅，重庆英格造粒包衣技术有限公司；1260高效液相色谱仪和VK7030全自动溶出仪，美国Agilent公司。

健康比格犬6只，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供，雌雄各半，体重(12±2)kg。

1.2DNJ双层渗透泵片的制备

1.2.1基本处方 在前期实验的基础上确定了基本处方，具体见表1。

表1 DNJ 双层渗透片基本处方

1.2.2片芯的制备 DNJ双层渗透泵片由片芯和包裹片芯的带有释药孔的半透衣膜组成，其中片芯分别为含药层和助推层。含药层制备方法如下：按处方将药物DNJ与辅料PEO(Mr6×106)、HPMC E50混合均匀，加水制成软材，制备粒径为0.7～0.8 mm的颗粒，烘干得A颗粒[10-11]。

助推层制备方法如下：按处方将辅料PEO(Mr6×106)、氯化钠、HPMC E50混合均匀，加水制成软材，制备粒径为0.7～0.8 mm的颗粒，烘干得B颗粒。

将A颗粒和B颗粒分别加入滑石粉，采用单压冲片机，10 mm浅凹冲，将含药层和助推层压制成双层片芯[7]，片芯硬度为9 kg/cm2。

1.2.3包衣的制备 将CA 300 g溶于2 000 mL 50%乙醇中，然后再加入100 g的PEG 4000混合，搅拌2 h。在包衣锅转速为25 r/min，包衣液流量为7 mL/min，包衣床温度45 ℃的条件下对DNJ双层渗透泵片片芯进行包衣[12]。控制包衣的质量增率在3%，包衣后在45 ℃下干燥0.5 h。干燥后，将包衣片用激光打孔机打释药孔(孔径0.6～0.7 mm)，即为DNJ双层渗透泵片，含药量40 mg/片。

1.3体外释放度的测定

按《中国药典》2015年版四部通则释放度测定法第二法(桨法)测定[12]。溶出介质水900 mL，转速为50 r/min，在0.5、 1、 2、 4、 6、 8和12 h取适量溶液，以0.22 μm滤膜过滤，取滤液作为供试品溶液。取DNJ对照品，精密称定，加水溶解并稀释制成0.05 g/L DNJ作对照品溶液。精密量取供试品溶液及对照品溶液各10 μL，注入HPLC色谱仪[9]，记录色谱图，按外标法以峰面积计算每片的释放度。释放度(r)公式如下：

r=Ai×Mr/Xr×40

式中:Ai—供试品峰面积;Mr—对照品称样量;Xr—对照品含量; 40为每片含40 mg 1-脱氧野尻霉素。

精密称取1-脱氧野尻霉素对照品适量，分别加水制成质量浓度为10、 20、 30、 40、 50和60 mg/L的系列标准溶液。以1-脱氧野尻霉素峰面积(A)对标准血药质量浓度(C,mg/L)进行线性回归，得标准曲线：C=1 214.5A-23.273，R2=0.998 9。在质量浓度10～60 mg/L范围内线性关系良好。

1.4释放度的影响因素考察

1.4.1含药层HPMC E50用量 HPMC E50作为含药层黏合剂，分别制备每片中羟丙基甲基纤维素E50用量为5、 10和15 mg的优化处方后的DNJ双层渗透泵片，分别取6片测溶出曲线。

1.4.2助推层PEO用量 PEO(Mr6×106)作为助推材料，分别制备每片中PEO(Mr6×106)用量为70、 80和90 mg的1-脱氧野尻霉素双层渗透泵片，分别取6片测溶出曲线。

1.4.3包衣层CA用量 CA作为控释成膜材料，分别制备每片中CA用量为10、 15和20 mg的优化处方后的1-脱氧野尻霉素双层渗透泵片，分别取6片测溶出曲线。

1.4.4包衣层PEG 4000用量 PEG 4000作为包衣层致孔剂，分别制备每片中PEG 4000用量为4、 5和6 mg的优化处方后的DNJ双层渗透泵片，分别取6片测溶出曲线。

1.4.5体外不同pH值溶出介质 分别取6片优化处方后的DNJ双层渗透泵片以pH值1.2盐酸盐溶液、 pH值4.5醋酸盐溶液和水为溶出介质，测定溶出曲线。

1.5比格犬体内药动学实验

1.5.1血样的采集 取健康比格犬6只(雌雄各半)，随机分为两组，采用两制剂两周交叉进行设计试验。实验前禁食12 h，然后分别给药DNJ速释片及双层渗透泵片(主药用量为40 mg)，2次给药间隔为1周。实验前，在Beagle犬静脉处安置一支滞留针，给药前取空白血样，给药后0.5、 1、 2、 3、 4、 6、 8、 10、 12、 14、 18和24 h 取血3 mL，置于涂有肝素的离心管中，以3000 r/min离心15 min，取上层血浆，置于-20 ℃的冰箱里保存待测[13]。

1.5.2血浆样品的处理和测定 精密吸取血浆1 mL置于10 mL具塞离心试管中，加0.1 mg罗红霉素作为内标物，1 mol/L氢氧化钠100 μL，涡旋混匀30 s，加入3 mL乙醚-二氯甲烷(体积比3∶2)，涡旋振摇5 min，3000 r/min离心15 min后，定量吸取有机层2.5 mL放入另一洁净玻璃试管中，置于40 ℃恒温水浴中用氮气吹干，氮气吹干后的残渣加甲醇100 μL涡旋30 s，复溶后精密吸取20 μL注入HPLC中进行分析。

1.6分析测试方法

1.6.1高效液相色谱分析条件 采用十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱的填充剂，柱温为35 ℃，以0.05 mol/L醋酸铵溶液(pH值5.25±0.05)-乙腈(体积比47.5∶52.5)为流动相，流速为1.0 mL/min，检测波长为320 nm。

1.6.2标准曲线的绘制 精密称取DNJ对照品适量，分别加水制成质量浓度为0.5、 1.0、 1.5、 2.0、 2.5和3.0 mg/L的系列标准溶液。精密吸取空白血浆1 mL，置于10 mL具塞离心试管中，分别加入DNJ系列标准溶液，使血浆中的药物浓度分别为0.05、 0.10、 0.15、 0.20、 0.25和0.30 mg/L。按1.5.2节操作，以DNJ峰面积(A)对标准血药质量浓度(C)进行线性回归，得标准曲线：C=1452.9A-14.753，R2=0.9981，在质量浓度0.05～0.3 mg/L范围内线性关系良好。

2 结果与分析

2.1不同条件对体外释药性能的影响

2.1.1含药层HPMC E50用量 HPMC E50作为含药层黏合剂，分别制备每片中羟丙基甲基纤维素E50用量为5、 10和15 mg的双层渗透泵片，取6片测定溶出曲线。考察HPMC E50用量对药物释放度的影响，结果见图1。由图可知，随着双层渗透泵片中HPMC E50用量从5 mg 增加到15 mg，溶出释放变慢，这是由于HPMC为含药层的黏合剂，用于增大药物黏度，所以羟丙基甲基纤维素含量越高，药物溶出越慢。而溶出速率太快，会使双层渗透泵片的缓释能力减弱，溶出太慢则会使溶出时间过长，因此溶出速率居中比较适宜(下同)。综上，当HPMC用量为10 mg时，药物溶出速度最为适宜。

2.1.2助推层PEO用量 PEO作为助推材料，分别制备每片含PEO(Mr6×106)70、 80和90 mg的双层渗透泵片，取6片测溶出曲线。考察PEO用量对药物释放度的影响，结果见图2。

图1 不同HPMC E50用量药物溶出曲线Fig. 1 Drug dissolution curve with different dose of HPMC E50

图2 不同PEO(Mr 6×106)用量药物溶出曲线Fig. 2 Drug dissolution curve with different dose of PEO(Mr 6×106)

由图2可以看出，随着双层渗透泵中PEO用量从70 mg增加到90 mg，吸水膨胀速度加快，推动药物的力量变大，释放药物的速度加快，即PEO用量越高溶出越快。当PEO用量为80 mg时，药物溶出速度最为适宜。

2.1.3包衣层CA用量 CA作为控释成膜材料，分别制备每片含CA 10、 15和20 mg的双层渗透泵片，取6片测释放曲线。考察CA用量对药物释放度的影响，结果见图3。

由图3可知，随着双层渗透泵片中的CA(控释成膜材料)的用量从10 mg增加至20 mg，薄膜包衣层增厚，吸收水分速度变慢，助推层吸水膨胀速度变慢，推动药物力量变小，药物溶出变慢，即CA用量越高溶出越慢。当每片含CA用量为15 mg时，药物溶出速度最为适宜。

2.1.4包衣层PEG 4000用量 PEG 4000作为包衣层的致孔剂，分别制备每片中PEG 4000用量为4、 5和6 mg的双层渗透泵片，取6片测溶出曲线。考察PEG 4000用量对药物释放度的影响，结果见图4。

图3 不同CA用量药物溶出曲线Fig. 3 Drug dissolution curve with different dose of cellulose acetate

图4 不同PEG 4000用量药物溶出曲线Fig. 4 Drug dissolution curve with different dose of PEG 4000

由图4可知，随着双层渗透泵片中PEG 4000(包衣层的致孔剂)的用量从4 mg增至6 mg，控释膜上空隙增多，药物溶出加快，即PEG含量越高溶出越快。当PEG 4000用量为5 mg时，药物溶出速度最为适宜。

2.1.5pH值 分别取6片双层渗透泵片，以pH值1.2盐酸溶液(8.33 mL盐酸溶解于水至1000 mL)、pH值4.0醋酸盐溶液(醋酸和醋酸钠质量比为4.4∶1溶解于水至1000 mL)和水作为溶出介质，计算每片的释放度[14]，结果见图5。

从图5中可看出，DNJ双层透泵片在pH值1.2、pH值4.0、水介质(pH值7.0)中溶出速度基本一致，说明控释层包衣功能良好，不受体内pH值变化的影响。体内pH值从胃部的酸性到水的中性的变化，不影响DNJ双层渗透泵片药物释放的控释效果。药物12 h溶出完全，且全程近似恒速缓慢释放。

2.2双层渗透泵片在比格犬体内药动学

采用统计矩的非隔室动力学理论对6只比格犬的血药浓度进行处理[15-16]，其中药物释放的峰质量浓度(Cmax，μg/L)和达峰时间(tmax，h)均采用实测值。平均血药浓度-时间曲线如图6所示。速释片与双层渗透泵片主要药动学参数见表2。结果表明：速释片的Cmax为(987.0±114.3) μg/L，双层渗透泵片的Cmax为(478.1±88.7) μg/L，速释片的最高血药浓度约为双层渗透泵片的2倍；双层渗透泵片的tmax为(9.3±3.8) h与速释片的tmax为(4.4±2.2) h相比tmax显著延迟，达到了缓释的目的。AUC0～24 h为血药浓度-时间曲线下面积，由表2可以看出，速释片与双层渗透泵片数值接近，说明相对生物利用度相同，药效一致。

图5 1-脱氧野尻霉素在不同pH值介质中溶出曲线Fig. 5 Dissolution curve of 1-deoxynojirimycin in medium with different pH value

图6 比格犬口服DNJ速释片和双层渗透泵片后的经时血药浓度曲线(n=6)Fig. 6 Blood concentration and time curve of Beagle dogs after oral DNJ immediate release tablets and bi-layer osmotic pump tablets(n=6)

生物利用度是衡量药物吸收速度和程度的综合参数，是评价药物制剂质量的重要指标。以统计结果中的血药浓度-时间曲线下面积计算速释片与双层渗透泵片的相对生物利用度[17-18]，相对生物利用度的计算公式如下：

Fr=AUCT×DR/AUCR×DT×100%

式中：Fr—相对生物利用度，%； AUC—血药浓度-时间曲线下面积，μg·h/L；D—给药剂量，mg; T为双层渗透泵片(40 mg/片)， R为速释片(40 mg/片)。

与速释片相比，DNJ双层渗透泵片的相对生物利用度为(96.1±9.8)%，双层渗透泵片与速释片吸收程度生物等效，其90%置信区间为84.8%～103.7%。

表2 比格犬口服DNJ速释片和双层渗透泵片后药动学参数(n=6)

DNJ双层渗透泵片在体外pH值1.2、pH值4.0和水介质中溶出速度基本一致，说明控释层包衣功能良好，不受pH值变化的影响，呈线性恒速释放。在体内DNJ双层渗透泵片的tmax为(9.3±3.8) h与速释片的tmax为(4.4±2.2) h相比显著延迟，达到了缓控释的目的。速释片与双层渗透泵片的血药浓度-时间曲线下面积AUC0～24 h的数值接近，说明相对生物利用度相同。说明体内外药物相关性良好。

3 结 论

3.1以释放度为考核指标，根据基础配方优化了DNJ双层渗透泵片的处方，结果表明：在含药层HMPC E50用量 10 mg，助推层PEO用量80 mg，包衣层CA用量15 mg及PEG 4000用量5 mg的条件下，药物溶出速度最为适宜。

3.2体外释药实验表明，DNJ双层渗透泵片的溶出不受介质pH值的变化影响，药物12 h溶出完全，且恒速缓慢释放。

3.3通过比格犬体内的药动学研究可知，DNJ双层渗透泵片释放的达峰时间(tmax)为(9.3±3.8) h比速释片的tmax(4.4±2.2) h显著延迟，达到了缓释的目的；渗透泵片的相对生物利用度为(96.1±9.8)%，90%置信区间为84.8%～103.7%，与速释片吸收程度生物等效。