伊马替尼治疗慢性髓系白血病耐药机制研究进展

徐祥梅 邢宏运 韩丽英

慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML)是一种造血干细胞克隆增生性疾病，其发病机制以9号和22号染色体的长臂相互易位构成费城染色体为特征，该易位导致BCR-ABL融合基因编码产生具有高酪氨酸激酶活性肿瘤蛋白，并具有持续酪氨酸激酶活性，通过下游信号途径促进增生[1]。针对CML的治疗，经历了局部放射、白消安、羟基脲、干扰素等不同时代，到如今的TKI治疗时代，给CML患者的治疗带来的一个全新的时代。TKI在针对CML一线用药中地位极高，促使着对它的研究不断进步。目前国际上主要有三代TKI制剂，主要代表药物为IM、达沙替尼、普纳替尼。而对于绝大多数CML患者，IM仍然是以首先选择的推荐药物。在临床工作中，有一部分患者对IM产生原发或者继发耐药，影响患者疗效。研究表明[2]，IM耐药可能与BCR-ABL激酶区突变、BCR-ABL基因扩增、能量代谢异常、体内伊马替尼药代学、白血病干细胞等机制相关。

1 BCR-ABL激酶区突变

ABL激酶区基因改变是依赖BCR-ABL融合基因耐药中最常见的耐药机制，基因改变的后果是阻止与TKI结合。在临床中，多达40%的患者可能在使用TKI时出现ABL激酶区基因改变[2-3]。也有文献报道激酶区基因改变发生在30%～90%的对IM抵抗患者中[4]。在Cortes J等[5]研究报道中指出，在169例IM无效患者中共发现了94种ABL激酶区基因改变。最近报道[6]的ABL激酶区突变多达100多种，目前发现的BCR-ABL激酶区基因改变大致可分为4种类型：P环突变、IM结合位点突变(T315/F317)、催化结构域内突变和活化环(A-loop)突变。

1.1 P环突变P环即ATP结合环，位于第248-256氨基酸区域，是ATP磷酸盐结合的高保真区，该区域常见的突变类型包括有M244 V、G250 E、QZ52 H、Y253 F、Y253 H、E255 K、E255 V等[7]。文献报道有P环突变CML患者预后更差[8]。但后来研究发现，不是所有CML患者P环发生突变后具有相同的生物学特征及临床特点，比如，253密码子的突变显示出更大的转化潜能[9]。而在P环发生突变中，第255位密码子突变发生频率高[10]。总的来说，P环突变是伊马替尼耐药相关突变中较常见的突变部位。

1.2 伊马替尼结合位点突变(T315/F317) 这个部位的常见突变位点有F311 L、T315 A、T315 L、F317 L、F317 V等，这些突变通过影响伊马替尼与其结合位点的结合而导致耐药发生[10]。我们知道T315是一个管家基因残基，其作用是控制激酶活性位点的疏水区不被ATP结合[11]。315位的苏氨酸是一个重要的通过氢键与TKI结合的重要基团，当它被异亮氨酸替换后，影响了TKI与ABL激酶区结合，从而造成耐药[12]。而T1315的突变的后果是导致对所有ATP竞争抑制物耐药，突变导致苏氨酸被异亮氨酸替代，形成疏水口袋，阻止伊马替尼的结合，同时大量的异亮氨酸支链在伊马替尼结合位点的中心会形成空间阻碍，阻止激酶抑制剂发挥作用[13]。研究发现第二代TKI抑制剂，如达沙替尼、尼罗替尼和伯舒替尼对其他突变有效，但对T315 I突变均无效[14]。研究也显示，有T315 I突变的CML患者，预后差[15]。

1.3 催化结构域内突变 催化结构域位点在350～363氨基酸区域，该区域突变主要影响激酶活性。发生在该区域常见的突变有M351 T、E355 G、F359 V、F359 C等，体外诱变实验表明有些突变细胞株对伊马替尼耐药，但对二代酪氨酸激酶抑制剂却敏感[10，16]。

1.4 活化环 (A-loop) 突变 A-loop结构包括第381-402位氨基酸，起调节激酶活性的作用，阻止激酶向无活性状态转化从而使IM 失效。常见活性环突变位点包括L387 M、M388 L、I1396 R、A433 T、FA53 K、FA59 C、FA59 K、E459 Q、F486 S等，其引起IM抵抗是依靠阻碍ABL构象改变成适合IM牢固结合的结构[17]。2016版NCCN CML指南[18]和2016年中国慢性髓性白血病诊断与治疗指南[19]，在临床中，参考上述相关指南，我们可以发现ABL激酶区众多突变类型中，其中7种有明确指出怎样换用TKI或者给予其他方式治疗：T315 I突变，对一代及二代TKI均无效，在这种情况下可选择进行临床试验，或者选择另外治疗方式；F317 L/V/I/C、V299 L、T315 A突变，一代TKI耐药，可考虑采用二代TKI尼洛替尼或者选择其他恰当治疗方案；Y253 H、E255 K/V、F359 C/V/I突变，接受达沙替尼方案可以更能获得满意疗效。针对T315 I突变，可以有第三代TKI普纳替尼，但目前该药物未在国内有使用。也有报道指出，一些CML患者在初始使用普纳替尼有效，但是由于持续使用TKI导致激酶区复合突变形成，并对普纳替尼产生耐药[20]。体外研究发现，镍硫酮可以诱导依托于BCR-ABL和非依托于BCR-ABL融合基因对IM耐药的CML细胞凋亡，这可能为TKI耐药提供一个新的治疗方法[21]。

高三尖杉酯碱(Homoharringtonine，HHT)可阻止蛋白合成和促进细胞凋亡。Cortes等研究发现[22]应用HHT治疗TKI治疗失败或存在 T315 I突变患者的Ⅱ期临床试验中发现，对于CML-CP的患者，77%患者可以达到CHR标准，10%可获得完全细胞遗传学缓解(CCyR)。正因为HHT治疗对TKI耐药的CML-CP或CML-AP患者均有用。因此，在2014年，美国FAD批准HHT可以用在CML患者身上[23]。2015年，有研究证明阿昔替尼，被获许可以用来医治晚期肾脏肿瘤的TKI，表现出对发生T315 I突变的CML患者的恶性细胞有抑制作用。

2 BCR-ABL基因扩增

BCR/ABL融合基因扩增、过度转录增多，这个现象在体内体外都已经被观察到[24-25]。Lee等[26]研究发现，BCR/ABL融合基因转录增多为引起CML患者对TKI抵抗的重要因素，部分患者可以通过提高TKI用药量来达到克服抵抗目的。Gorre等[27]发现，11例非先天性耐药患者中有3例患者通过检测，发现BCR-ABL基因转录增加。

3 能量代谢异常与耐药

近年来，白血病细胞发生对化疗药物耐药的现象涉及到能量代谢异常的现象引起了学者们的高度关注[28]。研究人员在急性白血病耐药细胞的研究中观察到相关葡萄糖代谢方面基因表达有增加[29-30]。Hulleman等[31]研究观察到糖酵解抑制剂的使用可以使耐药的白血病细胞敏感性增加。进一步研究发现糖酵解的抑制作用是通过诱导配体介导Fas或肿瘤坏死因子相关凋亡来实现[32]。宋奎等[33]研究也发现，以慢性髓系白血病细胞株K562及K562 R为研究对象，用PCR及Western blot方法检测两种细胞株中相关的糖酵解基因，结果显示耐药细胞株中的糖酵解相关基因活性增加。

4 体内IM药代学与耐药

肝脏是体内药物代谢极为重要部位，许多药物主要依赖肝P450酶系代谢。服用IM后，其在体内的绝度生物利用度高达98%[34]，治疗浓度中，至少95%的IM与血浆白蛋白结合，并且主要是与血浆α1-酸性糖蛋白结合 (AGP)。α1-AGP浓度越大，血浆中未结合IM浓度就低，则IM肝清除率越低；而不同肝脏代谢水平的CML患者，其IM清除率亦不一样，因此，α1-酸性糖蛋白水平影响IM血浆药物浓度及细胞内分布。上述因素最后结果是引起CML患者不同人体间IM血药浓度水平有较大不一样[35]。在研究如何提高IM对CML敏感性的方法中指出多药耐药(multidrug resistance，MDR)的存在，它是一个非单一基因介入的过程，涉及多种抗药相关的蛋白质，其中MDR1编码的P-gp蛋白介导的MDR现阶段有最多相关研究[36]。P-gp是ATP依托性的药物泵，依靠水解ATP达到供能量目的，把进入细胞内的药物泵出细胞，因此P-gp活性高的细胞内IM的水平较低[37]。P-gp抑制剂依靠竞争性结合P-gp，使IM在细胞内集聚，增加CML细胞中IM浓度，从而使其敏感性提高[38]。由此，我们可以得出IM体内药代学情况会影响细胞内药物浓度，从而影响疗效，出现耐药。

5 CML干细胞

我们知道，白血病干细胞(leukemia stem cells，LSC)拥有不受控制的自我更新和快速倍增能力，同时还拥有分化为多种其他细胞可能，并且在治疗中不被影响。它的存在会造成白血病耐药及复发，发生这类情况主要原因是绝大部分LSC处于静止(GO)期。而这类细胞不能被一般治疗肿瘤的药物清除。早在2004年，CML干细胞就被确认[39]，随后有相关文献对其特点进行研究报道，房佰俊等[40]通过分离提取CML患者骨髓中的BCR/ABL＋Flkl＋CD34－的细胞，在植入经亚致死量照射的NOD/SCID小鼠体内，成功复制出CML模型，这进一步证实了LSCs的存在。李珍等[41]也对LSCs特点进行阐述，它具有可以通过抑制某些信号传导途径(如：JAK-STAT途径、WNT/β-catenin信号通等)调节BCR/ABLl的稳定、抑制自噬等作用以维持其在体内残留的特点。Fang等[42]的研究，在对bcr/abl＋Flk1＋CD31－CD34－细胞的研究中证实，IM对非幼稚的恶性白血病细胞具有明显的阻滞其生长作用，但对CML的原始LSCs则可能是部分、甚至是完全无效的。因BCR-ABL激酶区活性在使用TKI治疗时被抑制，选择性保护机制使LSCs处于静止状态而保持其活性[43]。

我们知道，正常造血干细胞的正常生长受到骨髓微环境的影响，同样，有研究表明，LSCs也受骨髓微环境的调节，并且通过微环境中的物质相互作用可能对LSCs在TKI治疗时起到保护作用[44]。因此，LSCs的存在是绝大多数CML复发根源。

在维持骨髓中残留白血病细胞不能被检出的CML患者中，有约一半患者在停用TKI治疗后，疾病能够处于长期缓解状态，但是绝大多数CML患者仍然需要长期持续使用TKI以防止疾病复发，由此带来的药物毒性、巨大花费等不利因素。因此，亟需有针对LSCs的靶向药物出现。近年来，随着对白血病干细胞的研究深入，针对CML干细胞的治疗药物有的还在试验阶段，有的已应用于临床。Puneet等[45]研究发现，PORCN抑制剂专门针对LSCs或更早期细胞，能够有效抑制Wnt信号通路，并且对正常造血没有影响。

综上所述，CML对IM耐药机制极其复杂，在临床工作中，我们在对所有一线使用以IM的CML患者，在各时间段未达到最佳反应者，应该实时评估患者情况，包括患者治疗遵医嘱程度、对药物是否发生严重副反应等因素，必要时需要完善ABL激酶区基因突变检测等，以便可以恰当改变治疗策略，以尽可能避免疾病进展，延长患者寿命，提高患者生活质量。同时，针对耐药发生机制，可以尝试联合使用其他作用机制抑制肿瘤细胞的药物治疗，使患者获益。