肺癌早期筛查方法的研究进展

王水莲，杨芳

吉林大学第一医院肿瘤中心，长春 130021

肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，由于其发病隐匿，早期临床症状不典型，诊断率较低，具有高发病率与高病死率的特点，严重危害人类健康与生命安全。文献报道，2015年中国肺癌新发病例约73万，死亡病例约61万[1]。另有文献报道，仅16%的肺癌患者在早期被诊断，大多数患者就诊时疾病已进展至晚期，错过了最佳治疗时机[2]。肺癌患者的预后与临床分期密切相关，Ⅳ期肺癌患者的5年生存率仅为4%[2]，而ⅠA期肺癌患者接受合理治疗后，10年生存率可高达92%[3]。因此，早筛查、早诊断、及时进行临床干预是改善肺癌预后的关键。

作为肺癌早期的常规筛查手段，应在兼具无创、不良反应小、操作简便、费用合理等要求的同时，尽可能提高检出率。目前针对肺癌早期筛查的方法主要包括影像学和生物学方法，即胸部X线检查、胸部CT、血清生物学标志物等诊断技术。此外，痰脱落细胞学检查因取材方便、可反复取材、操作简单易行、患者痛苦小等特点，也是肺癌早期筛查的方法之一。本文主要对目前的肺癌早期筛查方法进行归纳总结。

1 痰脱落细胞学检查

采用痰脱落细胞学检查对肺癌进行早期筛查，是建立在对肺癌细胞形态学识别的基础上发现早期肺癌的一种重要手段。研究表明，痰脱落细胞学检查诊断肺癌的灵敏度为16%，特异度为99%，此项检查技术对中心型鳞状细胞癌最敏感，对腺癌则敏感性较差[4-5]。应用传统的痰细胞涂片技术，恶性肿瘤细胞在污秽的背景中呈散杂或成群排列，细胞缺乏完整性，细胞核结构不清，且多混杂于黏液中，给读片带来难度，加之痰标本中肿瘤细胞过少、细胞易变形、组织变异和形态上的不典型增生等多方面影响，其阳性检出率偏低，漏诊率较高。随后采用薄层液基细胞学技术用于痰脱落细胞学检查，由于薄层细胞涂片去除了黏液、红细胞等杂质成分，保证了细胞的完整无损，提高了肿瘤细胞的阳性检出率。薄层液基细胞学技术检测肺癌的灵敏度为87.5%，与传统的涂片法相比，灵敏度提高了24.5%[6]。但是，薄层液基细胞学涂片由于在标本处理时破坏了肿瘤细胞的排列方式和涂片背景，不利于病理分类。因此，临床上往往把痰脱落细胞学检查与其他检测技术联合应用。

2 影像学检查

2.1 胸部X线检查

胸部X线检查是传统的影像学检查手段，能够观察胸部结构的整体，具有经济方便、放射剂量小等特点，主要用于初步检查，便于发现一些较明显的病变。但是该检查是一种重叠成像，整体分辨率较低，对于密度低的小病灶及隐蔽性好的病灶易漏诊，对无症状小结节的Ⅰ期肺癌患者常效果欠佳。因此，仅依靠X线检查难以确保诊断的全面性和准确性。

肺癌筛查的大样本研究结果显示，胸部X线检查单独应用或与痰脱落细胞学检查联合应用时，不能降低肺癌患者的病死率[7-8]。

2.2 胸部CT

胸部CT横断面成像技术去除了组织重叠成像的干扰，且分辨率高，能够有效提高对肺内孤立结节、隐蔽部位微小病灶定位诊断的准确性及可靠性。国际肺癌筛查组织对31 567例无症状的肺癌高危人群进行CT筛查，肺癌检出率为1.5%（484/31 567），其中85%属于Ⅰ期肺癌[3]，CT对早期肺癌的检出率是胸部X线检查的6倍[9]。但常规CT的放射剂量大，扫描时间长，不适用于肺癌筛查。低剂量CT（low-dose computed tomography，LDCT）仅需患者屏息数秒即可完成胸部扫描，其放射剂量仅为3.3 mV，相当于一个人全年自然环境的放射总量。与常规CT相比，LDCT对肺内小结节有着相同的检出能力[10]。美国国家肺癌筛查试验（National Lung Screening Trial，NLST）研究结果显示，与胸部X线检查相比，LDCT可将肺癌的病死率降低20%～30%。随后美国国立综合癌症网络（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）更新了肺癌筛查指南，以Ⅰ类证据级别推荐在高危人群中采用LDCT作为肺癌早期筛查手段[11]。

然而，LDCT筛查也存在很多问题，包括假阳性率高以及假阳性结果引起的心理焦虑、过度诊断、辐射风险、对结节的鉴别能力较差、医疗费用较高等问题[12]。其中，假阳性率过高是LDCT筛查最突出的问题。在NLST中，3轮筛查的阳性率分别为27.3%、27.9%和16.8%，总阳性筛查率为24.2%（X线组为6.95%），但阳性结果中有96.4%为假阳性[13]。Croswell等[14]对LDCT筛查和胸部X线检查的假阳性率进行比较分析，结果显示，1次LDCT筛查的假阳性率为21%，X线组为9%；2次LDCT筛查的累积假阳性率为33%，X线组为15%；在LDCT组中，7%的假阳性患者接受了侵入性检查，而X线组为4%。

因此，单纯依靠LDCT进行肺癌早期筛查并不能对疾病做出准确判断。针对高危人群进行肺癌早期筛查，筛查方法应具有无创、价格合理、可普及等特点，随着分子生物学技术的发展，一些新型的灵敏度和特异度较高的肺癌血清学生物标志物与LDCT联合应用，有望进一步提高早期肺癌的检出率与诊断准确度。

3 血清学生物标志物

目前，病理组织活检依然是肺癌诊断的金标准，随着免疫组织化学技术的发展，采用荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）或新一代的基因测序技术对驱动基因进行测序已经成为标准诊疗程序。然而组织活检是侵入性检查，理想的检查方法在涵盖肿瘤生物学特征和异质性的同时，还应具有可重复性并易于操作。肿瘤血清学生物标志物是由肿瘤细胞或肿瘤微环境分泌而正常组织不能分泌或生成的物质，在人体的体液（血液、尿液、痰液等）中可以被检测到。目前应用于肺癌早期筛查的生物学标志物主要有肿瘤标志物、肺癌自身抗体、循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）、血清微小 RNA（microRNA，miRNA）等。血清学生物标志物检测方法具有取材方便的优势，可以实时监测肿瘤的动态变化，随着分子生物学技术的不断成熟，其诊断价值受到了广泛关注。

3.1 肿瘤标志物

肿瘤标志物是肿瘤发生发展过程中，由肿瘤细胞本身产生或是机体对肿瘤细胞反应而产生的物质，在肿瘤组织中的含量明显升高[15]。目前已经发现多种肿瘤标志物与肿瘤的诊断、分期、治疗及预后有关。临床上广泛应用的肺癌肿瘤标志物主要有癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、细胞角质蛋白19片段抗原21-1（cyto-keratin 19 fragment antigen 21-1，CYFRA21-1）、胃泌素释放肽前体（precursor of gastrin-releasing peptide，proGRP）和鳞状上皮细胞癌抗原（squamous cell carcinoma antigen，SCCA）。研究表明，proGRP在小细胞肺癌患者血清中的含量明显升高，其诊断小细胞肺癌的灵敏度为75%，特异度为100%；CEA在肺腺癌患者血清中的含量较高；CYFRA21-1和SCCA在鳞状细胞癌患者血清中的含量较高。单一肿瘤标志物检测的灵敏度和特异度均不高，若4种标志物（CEA+CYFRA21-1+proGRP+SCCA）联合检测，灵敏度可达76.6%，特异度可达94.4%[16]。虽然这些标志物在肺癌患者血清中的含量较高，但在一些肺部良性病变和其他肿瘤中，也可呈现阳性结果。鉴于肺癌组织病理的多样性、肺癌的异质性以及生物学行为的复杂性，目前尚未发现某种灵敏度和特异度均较高的肿瘤标志物，哪些标志物联合检测的特异度和灵敏度最高仍是该领域的研究热点。

3.2 CTC

CTC是在某些情况下从原发肿瘤或转移瘤中脱落，进入血液循环的肿瘤细胞。Tanaka等[17]研究发现，肺癌患者血清中CTC的数量明显多于非恶性疾病患者，30.6%的早期肺癌患者可检测到CTC，并且随着肺癌的进展，CTC计数显著增加。该研究结果提示，对疑似肺癌患者进行CTC检测，并在分子水平上监测病情变化，有助于发现早期肺癌。CellSearch系统是美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准用于CTC富集的系统，其工作原理是上皮来源的肿瘤细胞表面可表达上皮细胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）和细胞角蛋白（CK8、CK18、CK19），包被在磁珠上的EpCAM抗体能够与肿瘤细胞表面的相关抗原特异性结合，然后对富集的样本进行免疫荧光标记（CK-PE和CD45），最后筛选出EpCAM（+）CK-PE（+）CD45（-）的肿瘤细胞[18]。尽管CellSearch系统被广泛应用，但其对早期肺癌诊断的灵敏度和特异度均不高，例如在糖尿病、甲状腺疾病、高胆固醇血症和良性乳腺病变中均可检测到CTC[19]。此外，肿瘤细胞在侵袭转移的过程中可能发生上皮-间充质转化，而丢失了细胞表面的EpCAM，导致出现漏检[20]。另一项CTC检测技术是由中国国家食品药品监督管理总局（China Food and Drug Administration，CFDA）批准的叶酸受体（folate receptor，FR）靶向聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）技术。在一些肿瘤组织（如卵巢癌和肺癌组织）中，FR的表达量明显升高，而在正常组织中，其表达量很低[21]。采用免疫磁珠可以负向富集FR阳性的CTC，然后通过配体靶向PCR定量检测CTC。有研究表明，FR靶向PCR诊断肺癌的灵敏度为79.6%，特异度为88.2%[22]，对Ⅰ期非小细胞肺癌诊断的灵敏度达67.2%[23]。虽然近几年各种检测技术不断成熟，但CTC检测仍然存在着挑战，外周血中CTC的含量极低，在10亿个血细胞中仅有几个CTC，这也是限制CTC在临床上广泛应用的主要原因。改进检测方法、开发新型检测工具、提高CTC检测的灵敏度，有助于将CTC早日应用于临床检测。

3.3 循环肿瘤DNA

循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）是肿瘤细胞释放到血液中的单链或双链DNA分子，它来源于肿瘤细胞，因此携带原始肿瘤细胞的基因信息。近年来，随着肿瘤基因组计划的完善和下一代测序（next generation sequencing，NGS）技术的发展，基于ctDNA分析的液体活检技术可以通过检测突变状态反映肿瘤的基因组信息，为肿瘤的诊断和疗效评估提供新线索[24]。Newman等[25]采用肿瘤个性化深度测序分析方法（cancer personalized profiling by deep sequencing，CAPP-Seq）对Ⅱ～Ⅳ期非小细胞肺癌患者进行ctDNA检测，灵敏度达到100%；对Ⅰ期非小细胞肺癌患者进行ctDNA检测，灵敏度为50%，特异度为96%。ctDNA在血液中的浓度很低，且以碎片化形式存在，这是ctDNA检测的主要难题。目前ctDNA的检测方法主要有数字PCR（digital PCR，dPCR）、基于流式技术的磁珠乳液扩增方法（bead,emulsion,amplification and magnetic，BEAMing）、标记扩序（tagged-amplicon deep sequencing，TAm-Seq）技术、实时荧光定量PCR、NGS和CAPP-Seq等，这些检测技术的发展和应用，使ctDNA的检出率有所增加[26]。但是，目前对ctDNA的研究仍处于前期阶段，ctDNA的大小、释放机制等问题尚未明确；现有检测技术对ctDNA检测的灵敏度和特异度均不理想。此外，肺癌的异质性大、突变谱广，尚未发现诊断早期肺癌的标准ctDNA种类或组合。因此，ctDNA作为肺癌早期筛查方法在人群中的普及仍需进一步的研究。

3.4 血清miRNA

miRNA是一类由20～25个核苷酸组成的内源性非编码RNA，它们几乎参与所有细胞生物学行为的调控，并在肿瘤的发生、发展中发挥重要作用。Chen等[27]研究表明，血液miRNA耐酸、耐碱、耐高温，并能抵抗内源性或外源性RNA酶的降解，在血清中稳定存在。Halvorsen等[28]研究表明，肺癌患者与慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）患者和健康者的血清miRNA含量不同，并验证了6种miRNA（miRNA-429、miRNA-205、miRNA-200b、miRNA-203、miRNA-125b和miRNA-34b）在非小细胞肺癌患者中的含量显著升高，联合检测诊断Ⅰ～Ⅱ期肺癌的灵敏度为85%，特异度为74%，曲线下面积为0.88。该研究表明，miRNA具有检测早期肺癌的能力。Bianchi等[29]通过大型试验开发了34种miRNA组合，该组合在无症状的高危人群中识别非小细胞肺癌的准确率为80%。肺癌患者体内存在大量差异表达的miRNA，大部分miRNA并非由肿瘤细胞释放，哪些miRNA分子在肺癌的早期诊断中具有重要价值目前尚未明确。因此，筛选肺癌特异性miRNA分子、简化miRNA分子组合、优化检测技术，是血清miRNA应用于肺癌早期诊断的关键。

3.5 肺癌自身抗体

在肿瘤发病早期，机体的免疫系统即可识别肿瘤细胞内异常表达的蛋白，即肿瘤相关抗原，并分泌针对这些抗原的自身抗体。多项研究显示，在乳腺癌、食管癌、肝癌、卵巢癌患者的血清中均可检测到相应的抗体[30-33]。因此，自身抗体是诊断早期恶性肿瘤的潜在生物学标志物。与痰脱落细胞学检查和CT检查相比，自身抗体检测具有以下优势：①早期诊断的灵敏度高，在肿瘤患者出现临床症状前就能够检测到自身抗体的存在；②自身抗体在健康人的血清中没有或含量很低，在肿瘤患者中的含量较高；③与抗原相比，自身抗体的血清半衰期较长，稳定性较好；④血清样本易获得，检测无创伤，操作简单，反应灵敏，可对不同阶段的肿瘤进行检测。

Chapman等[34]对肺癌患者和健康人血清中的7种抗体（p53、c-MYC、HER2、NY-ESO-1、CAGE、MUC1、GBU4-5）的表达水平进行了检测，发现肺癌患者血清中的抗体水平高于健康人；单一抗体的阳性率为5%～36%，联合检测的灵敏度为76%，特异度为92%。这一结果提示，单一抗体检测的灵敏度较低，诊断效能不佳，而多种抗体联合检测则能够弥补单一抗体阳性率较低的不足，进而有效提高肺癌的检出率。Boyle等[35]研究发现，6种抗体（p53、NY-ESO-1、CAGE、GBU4-5、Annexin1、SOX2）联合检测对不同分型、分期肺癌的灵敏度及特异度无明显差异，提示该抗体组合在不同分型、分期的肺癌组织中表达稳定，对各个分期的肺癌均有诊断意义。Chapman等[36]对小细胞肺癌患者进行检测，在原有6种抗体组合的基础上加入HuD抗体，结果显示，该抗体组合对小细胞肺癌的诊断具有良好的灵敏度和特异度，但Annexin1抗体的灵敏度仅为2%。Chapman等[37]进一步优化抗体组合，对235例肺癌患者进行新的7种抗体组合（p53、NY-ESO-1、CAGE、GBU4-5、SOX2、HuD、MAGEA4）的检测，此次优化移除了原来灵敏度较低的Annexin1抗体，新加入了MAGEA4抗体。研究结果显示，新的7种抗体组合的灵敏度为41%，特异度为93%，这7种抗体组合被称为EarlyCDTLung。Jett等[38]对1613例肺癌高危人群进行EarlyCDT-Lung检测，灵敏度为41%，其中Ⅰ～Ⅱ期肺癌患者占57%。以上结果提示，自身抗体联合检测有助于发现早期肺癌。2012年英国国家医疗服务体系在苏格兰地区进行一项大型前瞻性研究，纳入12 000例高风险吸烟人群并进行EarlyCDT-Lung检测，主要目的是评估EarlyCDT-Lung诊断肺癌的能力，并进一步探究早期检测是否能使患者长期获益[39]。该研究的最终结果预计在2019年公布，其结论将明确EarlyCDT-Lung是否可以作为肺癌早期检测指标在英国开展以及在全世界范围内广泛应用。

中国也有多个课题组进行了相关研究，Ren等[40]评估了7种肺癌抗体筛查肺癌的临床价值，考虑人种、遗传差异与肺癌的异质性，与国外研究的抗体相比，中国选择的7种肺癌抗体（p53、GAGE7、PGP9.5、CAGE、MAGEA1、SOX2、GBU4-5）中，4种与国外相同，3种不同。研究纳入818例肺癌患者和1176例肺部良性疾病患者，肺癌抗体诊断的灵敏度为61%，特异度为90%；对Ⅰ期和Ⅱ期非小细胞肺癌的灵敏度分别为62%和59%，对局限期小细胞肺癌的灵敏度为59%，对肺部良性疾病患者的特异度高达94%。在此项试验的540例肺部结节患者中，高分辨率CT（high resolution computed tomography，HRCT）与肺癌抗体联合诊断的阳性预测值（90.4%）远远高于单独HRCT诊断的阳性预测值（57.6%）。2015年CFDA批准了肺癌抗体检测试剂盒上市，但目前尚未在临床广泛应用。以上研究结果均表明，自身抗体联合检测有助于肺癌的早期诊断，但其灵敏度不足，单独应用不能满足肺癌早期筛查的需求。因此，进一步提高抗体组合的稳定性和特异性，寻找最佳的早期肺癌抗体组合，并将其与LDCT联合，或许是肺癌早期筛查的理想模式。

4 小结与展望

建立肺癌早期筛查临床路径是提高肺癌早期诊断率，改善患者预后的关键。目前尚没有理想的肺癌筛查模式，血清学生物标志物检测与LDCT在肺癌早期诊断中均显示了良好的诊断效能，二者联合有望成为肺癌早期筛查的理想模式。然而目前对于LDCT筛查肺癌的人群选择、诊断以及随访原则尚未统一，血清学生物标志物的灵敏度不足，检测组合种类繁多，检测技术不完善，寻找灵敏度和特异度高的检测组合，仍需进行大量的临床研究。