循环肿瘤细胞在小细胞肺癌中的研究进展△

王莹，张同梅，李宝兰#

1首都医科大学石景山教学医院北京市石景山医院肿瘤科，北京 100043

2首都医科大学附属北京市胸科医院，北京市结核病胸部肿瘤研究所综合科，北京 101149

肺癌是世界范围内肿瘤患者死亡的首要原因，其中小细胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）占全部肺癌患者的13%～15%[1]。目前针对SCLC的治疗仍以放化疗为主，虽然SCLC对化疗药物高度敏感，但大部分患者1年内出现复发转移，且转移病灶多为远处脏器[2]，循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）被认为是肿瘤复发及转移的根源[3]。SCLC的生物学特性与非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）完全不同，在疾病早期外周血中已经存在CTC，且SCLC患者CTC的数量明显高于NSCLC患者，CTC与预后及疗效相关[4-5]。由于CTC表型、表达谱与原发肿瘤具有同源性，且获取标本方便，可重复性强，因此，实时检测CTC，对SCLC的早期诊断、复发监测、疗效评估、制定个体化治疗方案及判断预后均有重要的临床意义。

1 CTC的检测方法

在外周血中CTC数量稀少，如何对其进行精准检测一直是学术界研究的难点及热点，理想的CTC分离检测方法应兼顾灵敏度、特异度，并对细胞纯度、细胞活力及检测效率有较高的要求。CTC的获取通常由富集和检测两个部分组成，现有的富集方法主要针对肿瘤细胞的生物、物理学特性进行，包括依赖肿瘤细胞大小的过滤法和依赖肿瘤标志物的富集法，后者又分为阴性富集法和阳性富集法。阴性富集即差相富集，通过标记去除非CTC达到间接分离的目的；阳性富集即抗体捕获，指利用肿瘤标志物直接获取CTC。后续的鉴定包括细胞和核酸水平的检测。目前，主流检测技术包括细胞水平的CellSearch、CTC芯片、插入人端粒酶启动子和绿色荧光蛋白基因的单纯疱疹病毒法（oHSV1-hTERT-GFP）、流式细胞检测技术（flow cytometry，FCM）和膜滤过分离肿瘤细胞技术（isolation by size of epithelial tumor cell，ISET）等；核酸水平的检测方法主要有实时定量逆转录聚合酶链反应（quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR）和差相富集-免疫荧光原位杂交技术（substrction enrichment and immunostaining fluorescence in situ hybridization，SE-iFISH）。以下简要概述当前具有代表性的3种检测方法。

1.1 CellSearch系统

CellSearch系统是唯一经美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准的CTC检测平台，可通过正向选择分离血液中表达上皮细胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）的细胞，然后通过免疫荧光染色界定EpCAM阳性、CK阳性、DAPI阳性、CD45阴性的细胞为CTC。CellSearch系统自动化程度高且可重复性强，但该系统会遗漏缺失上皮细胞表面特征的肿瘤细胞，如经过上皮-间充质转换（epithelialmesenchymal transition，EMT）后的CTC，且与免疫磁珠及抗体结合后的CTC无法进行后续研究[6]。

1.2 qRT-PCR法

qRT-PCR法主要是通过检测外周血中肿瘤标志物mRNA来预估肿瘤细胞的存在。目前中国应用比较广泛的如靶向叶酸受体、EpCAM等不同标志物阳性的PCR检测CTC技术，qRT-PCR灵敏度高，可在106～107个外周血细胞中检测出单个肿瘤细胞，但因不同类型肿瘤的CTC之间存在肿瘤标志物表达量的差异，检测出的标志物含量并不能真实反映CTC数量，亦无法进行后续进一步研究[7]。

1.3 SE-iFISH技术

SE-iFISH结合了差相富集和免疫荧光原位分子探针技术，可对富集的CTC进行原位染色体异倍体检测，另外能结合不同的肿瘤标志物包括上皮细胞、间质细胞及干细胞进行检测。既避免了因EMT等原因导致的肿瘤标志物低表达甚至不表达进而造成假阴性结果，还能镜下观察染色体异倍体的CTC和循环肿瘤微栓（circulating tumor microemboli，CTM）。其优势在于可根据CTC肿瘤标志物的表达及染色体倍体的差异将具有不同临床意义的CTC进行亚类分型并进行后续研究[8]。该技术人工操作流程复杂，检测费用昂贵，可能会限制其临床应用，还需更多的后续研究以简化流程，降低检测成本。

2 CTC在SCLC中的临床应用

2.1 CTC与SCLC筛查及早期诊断

SCLC早期诊断是延长患者生存期的关键因素。早在20世纪90年代Kurusu等[9]应用逆转录聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）技术对103例有手术机会的早、中期NSCLC患者进行术前CTC检测，发现62例阳性，而对照组47例（15例肺间质纤维化患者，32例健康人）均为阴性，提示CTC可于肺癌早期出现血源播散。SCLC较NSCLC更易于出现早期血行转移，但理论上CTC是远处转移的必要条件。临床上可以检测到实体瘤前，CTC已存在于外周血中，这一结论已经在小鼠恶性黑色素瘤模型上得到论证[10]，因此有效捕获CTC，可极大提高早期SCLC的诊断率。Ilie等[11]应用ISET技术对245例非肿瘤人群进行CTC检测，其中包括168例慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）患者，77例健康人（42例吸烟，35例不吸烟）。168例COPD患者中5例CTC检测阳性，该5例患者在后续1～4年的随访中均发现肺部结节并手术确诊为早期NSCLC，提示CTC检测可以早于胸部计算机断层扫描（computed tomography，CT）发现影像学不可见的早期肿瘤，其在肺癌早期筛查中有巨大的临床应用前景。随着中国胸部低剂量螺旋CT在肺癌早期筛查中的日渐普及，如何精准鉴别体检发现的肺部良恶性小结节是肿瘤科医师日常需要面临的临床问题，除需警惕影像学的高危征象及一系列的随访策略外，CTC检测能否在良恶性肺结节早期病变判断上占有一席之地得到关注。日本学者Tanaka等[12]应用CellSearch技术对150例疑为肺癌的患者进行CTC检测，结果提示125例最终确诊为肺癌的患者（腺癌85例，鳞癌22例，SCLC 9例，其他类型肺癌9例）中CTC的阳性率为30.6%，另外25例肺良性疾病患者的CTC阳性率为12.0%，肺癌患者的CTC数量明显高于肺部良性疾病患者，但受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve，ROC）分析显示，CTC检测对鉴别肺部良恶性疾病无临床意义[12]。而近年来中国Chen等[13]应用RT-PCR技术对756例受试者（473例NSCLC患者，227例肺部良性疾病患者，56例健康人）进行CTC检测时发现，NSCLC患者的CTC水平明显高于肺部良性疾病患者（P＜0.01）及健康人（P＜0.01）；ROC曲线分析显示，与血清癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、神经元特异性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）、细胞角质蛋白19片段抗原21-1（cyto-keratin 19 fragment antigen 21-1，CYFRA21-1）比较，CTC诊断效能更佳，其诊断Ⅰ期NSCLC的灵敏度可达67.2%，CTC检测联合上述3种肿瘤标志物诊断肺癌的灵敏度及特异度分别达88.78%、87.36%，可有效提高肺部良恶性疾病鉴别诊断的准确率。因此，CTC联合肿瘤标志物检测可在一定程度上弥补影像学诊断的不足，且操作简便，风险低。

2.2 CTC与SCLC疗效评价

当前SCLC患者的疗效评价主要通过影像测量肿瘤病灶大小进行判断，然而影像学检查时微转移病灶很难被发现。近年来研究表明，CTC在肺癌疗效预测及评价方面具有一定的临床价值。Nagrath等[14]应用CTC芯片技术对9例实体瘤（其中2例肺癌）患者进行动态监测CTC时发现，化疗前后CTC的数量变化与CT检查结果具有高度的一致性，相较于影像学检查，CTC动态监测能更早地评价药物疗效，辅助临床医师对化疗无效的患者更快地做出临床决策。Wu等[15]通过CellSearch系统对12例化疗2个周期的肺癌患者进行CTC数量监测时发现，CTC计数与影像学特征的变化趋势一致，CTC可作为肺癌患者化疗效果的有效评价指标。有关CTC在SCLC患者疗效评价中的意义仍存在一定的分歧。中国Wang等[16]在应用Cell-Search系统对96例SCLC初治患者于一线化疗前后进行CTC动态监测时发现，CTC数量与血清NSE水平相关，与药物客观缓解率（objective response rate，ORR）及疾病控制率（disease control rate，DCR）无关。而Normanno等[17]通过CellSearch系统对60例广泛期SCLC患者于化疗前及化疗1个周期后进行CTC数量监测时发现，54例（90%）SCLC初治患者的基线CTC检测阳性（CTC数量为0～24 281），化疗1个周期后CTC数量较基线水平减少＞89%的患者死亡风险明显小于基线水平减少≤89%的患者[风险比率（hazard ratio，HR）=0.24；95%CI：0.09～0.61]，该研究认为化疗 1 个周期后CTC数量变化是有效的疗效预测指标，可对后续治疗起到指导作用。中国Shen等[18]应用RT-PCR技术对80例SCLC患者叶酸受体阳性CTC进行动态监测，结果显示67例（83.8%）患者基线CTC阳性（每3 ml外周血CTC≥8.7 FU），化疗2个周期后CTC下降数量与肿瘤部分缓解（partial response，PR）相关（P=0.0380），但与疾病稳定（stable disease，SD）无关（P=0.4934）。因此，SCLC治疗过程中实时监测CTC，有一定的参考价值，但尚缺乏大样本前瞻性研究的相关证据支持。

2.3 CTC与SCLC预后判断

CTC数量与多种实体瘤患者的预后密切相关，基于前期多项临床研究，FDA已批准Cell-Search系统应用于转移性乳腺癌、结直肠癌和前列腺癌的预后评估以及无进展生存时间（progression free-survival，PFS）和总生存期（overall survival，OS）的预测[19-21]。当前临床医师判断SCLC预后主要依据肿瘤分期、肿瘤标志物水平及体能状态（performance status，PS）评分。CTC检测可以辅助其他参考指标有效判断肺癌预后。Aggarwal等[22]开展的一项前瞻性研究应用CellSearch系统对50例SCLC初诊患者（20例局限期，30例广泛期）化疗前及化疗1～4个周期后进行连续CTC检测，结果提示局限期SCLC患者的CTC基线水平明显低于广泛期SCLC患者（1.5vs71.0，P=0.0004），CTC基线水平＜50的患者PFS及OS明显高于≥50的患者，差异均有统计学意义（P=0.0002、0.0116）[22]。Shi等[23]通过聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）对55例SCLC患者化疗前及化疗1个周期、3个周期后外周血细胞角蛋白19（cytokeratin 19，CK19）mRNA进行检测，结果提示化疗前CTC检测阳性而化疗1、3个周期后转为阴性的患者的PFS、OS明显长于CTC检测连续阳性的患者（P=0.008、0.010），动态监测CK19阳性的CTC可有效判断SCLC患者预后。Hou等[24]应用CellSearch系统对50例SCLC患者外周血标本进行CTC检测，结果提示43例（86%）患者CTC阳性，CTC的中位数明显高于其他实体瘤，提示SCLC患者中Ep-CAM阳性的CTC数量丰富，进一步分析提示CTC数量＞300的患者OS明显低于CTC数量＜2的患者（P＜0.01）。上述各项研究纳入的病例数较少，CTC检测方法及临界值也不相同。Zhang等[25]对7项研究共计440例SCLC患者的相关数据进行了荟萃分析，结果提示基线CTC数量与患者OS（HR=1.9，95%CI：1.19～3.04；Z=2.67，P＜0.01）及 PFS（HR=2.6，95%CI：1.9～3.54；Z=6.04，P＜0.01）均有关。与上述结论不同，Hiltermann等[4]对59例SCLC患者的CTC进行检测，结果显示CTC基线数量与化疗疗效无关，化疗1个周期后CTC数量≥2是仅次于肿瘤分期的最佳预后评估指标（HR=3.1，95%CI：1.4～6.6；P＜0.01）。肿瘤组织分子标志物和CTC计数相结合可提供更多的临床信息，外周血中发生EMT和具有干细胞特性的CTC更容易发生免疫逃逸，成为肿瘤日后复发和转移的根源[26]。Hamilton和Rath[27]报道复发SCLC细胞株CTC中可见EMT相关转录因子上调，可能与肿瘤的侵袭性及远处转移特性相关。Chang等[28]报道SCLC患者上皮细胞标志物EpCAM的高表达提示预后较好。另有研究指出c-met过表达SCLC患者临床预后差[29]。然而，Pore等[30]利用免疫组化技术对38例SCLC原发肿瘤组织进行了干细胞及间质细胞标志物染色，结果发现SCLC肿瘤组织间质细胞表型（c-metHE-cadL），提示外周血CTC计数少，CTC≥2是优于疾病分期及CTC标志物的最佳生存预后评估指标（HR=3.43，95%CI：1.46～8.03；P=0.005），而肿瘤组织中干细胞标志物SOX2和CD44的表达与患者OS无关。因此，CTC在判断SCLC患者预后方面有重要的临床意义且研究结论较为一致，不同亚型CTC与预后的关系值得进一步探索。

2.4 CTC与SCLC复发、转移

SCLC患者对放化疗高度敏感，但后续的复发、转移是患者主要死亡原因，也是临床治疗难题，外周血中存活的CTC、CTM被认为是造成SCLC转移和复发的根源。美国癌症联合委员会（American Joint Committeeon Cancer，AJCC）2010年《肿瘤分期指南》将CTC作为一个新的M分期标准，作为 cM（i+）出现在 M0和M1之间[31]。文献报道，肺癌患者术后外周血中CTC的存在可有效提示肿瘤复发，CTC数量与淋巴结转移状态是肺癌根治术后患者无疾病生存期（disease-free survival，DFS）的独立影响因素[32]。另有研究发现，CTC数量与肿瘤远处转移病灶数目有明确的相关性，有远处转移的肺癌患者外周血CTC数量明显升高，CTC可作为监测肺癌转移的有效标志物[12]。目前针对CTC与SCLC复发、转移关系的文献报道仍然较少，期待能有更多、更客观的临床研究开展。

3 前景与展望

近年来，随着CTC富集与检测技术的不断革新，人们对CTC的临床应用有了更加深入的认识，有关CTC在SCLC领域中的研究也陆续更新。在当前精准医学的背景下，免疫检查点抑制剂及靶向治疗药物Rova-T的出现给SCLC的治疗困局带来新的希望，寻求可反复取样、动态监测的手段是对SCLC患者实施个体化治疗的前提。尽管CTC在SCLC的早期诊断、疗效评价、预后评估及复发检测方面的作用已被大量研究证实，但将CTC检测应用于SCLC临床实践中仍任重道远。首先，CTC检测技术的原理和方法不同导致检测结果及判读标准存在较大差异，CTC分离与鉴定技术亟待规范化和标准化；其次，CTC与SCLC疗效监测及预后关系缺乏多中心大样本研究结果确认；最后，CTC亚群CSC、EMT及CTM在SCLC患者中有不同的临床意义，探讨不同个体CTC分子表型差异及同一个体CTC的异质性，也将是未来的研究重点。