HPLC测定混合型饲料添加剂中L-苹果酸含量

■杨建平 陈鲜鑫 刘 星

（1.四川美嘉龙生物科技有限公司，四川乐山614000；2.乐山市农业科学研究院，四川乐山614000；3.四川省乐山市农业局，四川乐山614000）

L-苹果酸（L-malic acid，简称LMA)是生物体内三羧酸循环的成员之一[1-2],也是一种重要的有机酸，在化工、食品、医药、畜牧等行业领域具有广泛的用途[3]。在食品领域，L-苹果酸已成为继柠檬酸、乳酸之后，用量排第三位的食品酸味剂，同时L-苹果酸还可用于食品保鲜和除臭[4]。在医药行业中，L-苹果酸直接参与人体新陈代谢，具有抗疲劳、保护肝脏、肾脏、心脏的作用以及降低抗癌药物的毒副作用等[5-6]。它作为酸化剂和病原微生物的抑制剂已用于反刍动物。对动物的生理和营养作用主要表现在以下五方面：①改善胃肠道内微生物区系，抑制有害菌生长，促进有益菌增殖；②调节胃中pH值和减缓胃的排空速度，促进营养物质消化吸收；③直接参与体内代谢，提高营养物质消化率；④改善饲料适口性，增强食欲；⑤抗应激[7]和改善睡眠[8]。因此在动物饲料使用过程中替代胃酸，抑制病原微生物，减少抗生素使用，提高断奶仔猪的日增重有很好效果。目前L-苹果酸的国家标准检测方法为化学滴定法，该方法干扰多、误差大。本文采用高效液相色谱法测定混合型饲料添加剂中L-苹果酸含量，以此来解决在分析过程中干扰多、误差大、准确性低的问题。

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器

磷酸二氢钾：分析纯，成都科龙化工试剂厂，含量≥99.5%；磷酸：分析纯，成都科龙化工试剂厂，含量≥85.0%；乙腈：色谱纯，成都诺尔施化工试剂公司，含量≥99.9%；L-苹果酸对照品：中国食品药品检定研究院，含量≥99.0%。聚四氟乙烯膜滤纸，天津津腾。高效液相色谱仪[包括：紫外-可见光检测器(UV230Ⅱ)，色谱柱C18（250 mm×4.6 mm×5 μm推荐改性柱），EC2006色谱数据处理系统，自动进样器]，大连依利特分析仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 色谱条件

色谱柱：C18（250 mm×4.6 mm×5 μm改性柱）；流动相：0.02 mol/l磷酸二氢钾∶乙腈=98∶2（v∶v），用磷酸来调pH值2.3±0.05；柱温：25℃；检测波长为210 nm；流速：0.8 ml/min；进样量：10 μl。

1.2.2 检测方法

通过色谱柱使样品溶液中各组分分离，用紫外吸收检测器检测，用外标法定量，计算样品(混合型饲料添加剂苹果酸)中L-苹果酸的含量。

1.2.3 溶液的配制

1.2.3.1 0.02 mol/l磷酸二氢钾溶液的配制

称取磷酸二氢钾2.7 g加水溶解，并稀释至1 000 ml。

1.2.3.2 流动相的配制

0.02 mol/l磷酸二氢钾∶乙腈=98∶2（v∶v），用磷酸调pH值2.3±0.05，再经0.45 μm聚四氟乙烯膜滤膜过滤，即得。

1.2.3.3 对照品溶液的配制

精密称取苹果酸对照品10.0 mg左右（精确至0.000 02 g)至10 ml容量瓶中加入流动相5 ml，超声15 min，并用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液（每1 ml溶液约含苹果酸对照品1 mg）。

1.2.3.4 供试品溶液制备

取混合型饲料添加剂苹果酸样品3批次，精密称取样品125.0 mg左右（精确至0.000 02 g)至25 ml容量瓶中，再移取10 ml的流动相加入容量瓶中，超声15 min，并用流动相稀释至刻度，摇匀，过滤，取滤液作供试品溶液。

1.2.4 样品检测

按高效液相色谱操作规程开机，调节温度及流量，达到分析条件并基线平稳后，分别精密量取（或自动进样）供试品溶液和对照品溶液各10 μl注入液相色谱仪，记录色谱图。按外标法计算含量，即得。

1.2.5 标准曲线的绘制

将浓度为2 020、1 010、505、252.5、126.25 μg/ml的对照品溶液分别吸取10 μl注入HPLC，以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线。

1.2.6 精密度的测定

精密吸取苹果酸对照品溶液重复进样5次，测定峰面积，计算对照品峰面积积分值的RSD。

1.2.7 重复性的测定

分别称取同批苹果酸样品6份，采用高效液相色谱法测定苹果酸含量，并计算样品的RSD值。

1.2.8 回收率的测定

用加样回收试验，取已知含量的同一批供试品各9份，精密称定，分别精密添加一定量的苹果酸对照品，按供试品制备所述方法测定含量(同时测定样品含量)，计算回收率。

1.2.9 含量测定

取样品3批，按供试品制备方法制备样品，测定样品苹果酸的含量。

1.2.10 苹果酸含量计算

式中：w——苹果酸含量(%)；

CR——对照品的浓度(mg/ml)；

AX——样品的峰面积；

AR——对照品的峰面积；

V——样品溶液总体积(ml)；

n——样品稀释倍数；

m——试样的质量(mg)。

2 结果与分析

2.1 苹果酸对照品和样品的HPLC的色谱图（见图1、图2）

本实验条件下，样品处理简单省时，由色谱图1和图2中可见苹果酸对照品保留时间在3.9 min左右，而样品在3.9 min左右处也出现一个较好的峰形，并且基线平稳，说明此方法可行。

图1 苹果酸对照品HPLC色谱图

图2 样品HPLC色谱图

2.2 标准曲线的绘制

用不同浓度的标准品，检测出的峰面积结果，绘制标准曲线，结果见图3。

图3 绘制的标准曲线图

标准曲线实验所得回归方程为Y=0.390 9X-4.578 6，R=0.999 8(n=5)。试验表明，苹果酸对照品在126.25～2 020 μg/ml的范围内，线性关系良好，最低检测量为12.23 μg/ml。

2.3 精密度

精密取苹果酸对照品溶液重复进样5次。测得5次苹果酸的峰面积分别为800.71、795.73、796.71、794.83、791.34，峰面积平均值为 795.74±3.39，RSD=0.43%(n=5)，说明本法精密度良好。

表1 精密度结果

2.4 重复性

分别取同批苹果酸样品6份，采用高效液相色谱法测定，结果见表2。

表2结果显示，测得6份苹果酸样品的含量分别为98.89%，99.06%、99.38%、99.15%、98.96%和99.11%，含量平均值（99.09±0.001 7）%。RSD=0.17%(n=6)，说明本法重复性良好。

2.5 回收率

表2 6份苹果酸样品测定结果

用加样回收试验，取已知含量的同一批供试品各9份，回收率测定结果见表3。从表3可看出，回收率为(98.35±0.006)%，RSD=0.61%。

上述样品的精密度实验结果中苹果酸对照品峰面积积分值RSD为0.43%，表明此方法精密度较好；重复性结果苹果酸样品的RSD为0.17%，表明重复性良好；回收率实验结果显示回收率达到98.35%，RSD为0.61%。充分表明检测方法良好，适合其样品的检测。

表3 回收率测定结果

2.6 样品含量测定（见表4）

表4 样品含量结果（n=3）

由表4看出，本样品的苹果酸平均含量为（99.01±0.11）%，符合产品规定的质量要求。

3 讨论

L-苹果酸作为酸化剂和病原微生物抑制剂，具有酸味柔和、爽快、刺激性缓慢、保留时间长的特点，是一种优良的食品添加剂[9],已应用于反刍动物。同时L-苹果酸是瘤胃微生物代谢途径的中间产物，可被微生物或其他生化反应代谢利用，无残留，不存在微生物的耐药性、病原体抗药性转移和药物残留等问题，可更好的更有效的预防和控制反刍动物在饲喂过程中发生的瘤胃酸中毒[10]。在食品添加剂中对其检测尤其重要。由于L-苹果酸没有紫外或荧光吸收，很难直接检测，需经酸解成苹果酸单体后通过计算苹果酸的增加量来计算。目前常用的苹果酸检测方法有高效液相色谱法(HPLC)、酶试剂盒法、纸层析法、α-2，7-萘二酚法等[11]。以该方法测定其含量，相对其他含量测定方法更加具体和明确，质量控制方法更加科学[12]，可为混合饲料中测定L-苹果酸提供一定的依据。

4 结语

L-苹果酸对照品和样品的保留时间均是3.9 min，其线性方程为Y=0.390 9X-4.578 6，R=0.999 8(n=5)，在126.25～2 020 g/ml的范围内，线性关系良好，其最低检测量12.23 g/ml。精密度的RSD为0.43%，表明此方法精密度较好；重现性的RSD为0.17%，表明重现性良好；回收率的RSD为0.61%。用此方法检测出其混合饲料添加剂中L-苹果酸含量为(99.01±0.11)%，符合产品规定的质量要求。该实验建立的HPLC检测方法可以使混合饲料中L-苹果酸的测定快速、准确，为其质量控制提供科学依据。