甲荣康对甲减合并性腺功能减退大鼠卵巢组织InhBP免疫组化表达的影响

冯晓 蔡欣蕊 朱保霖 钱秋海 钱卫斌

摘要：目的觀察以健脾补肾、调肝活血、温通泻浊为治法组方的中药复方甲荣康对甲状腺功能减退模型大鼠卵巢组织InhBP表达的影响并探讨其机制。方法用他巴唑复制甲状腺功能减退大鼠模型，并分为5组（n=10）：模型对照组、西药对照组、甲荣康小、中、大剂量组，另加空白对照组，分别灌胃。药物干预6周后，采用免疫组化方法检测各组大鼠卵巢组织InhBP的表达。结果甲减模型大鼠卵巢组织InhBP表达水平明显升高，甲荣康可显著的降低模型大鼠卵巢组织InhBP表达水平，而且随着剂量的加大，疗效更加显著，明显优于对照组。结论InhBP的异常表达是甲减合并性腺功能减退的发病机制之一，通过健脾补肾、调肝活血、温通泻浊法对甲减合并性腺功能减退进行早期干预效果明显，甲荣康可能通过降低InhBP在模型大鼠卵巢组织中的异常表达对甲状腺及性腺功能起到保护作用，值得进一步深入研究。

关键词：甲荣康;甲状腺功能减退;性腺功能减退;InhBP;免疫组化

中图分类号：R2855     文献标志码：A    文章编号：1007-2349（2018）06-0062-03

Effect of Jiarongkang on InhBP Expression in Ovarian Tissue from Hypothyroidism and Hypogonadism Rats by Immunohistochemistry

FENG Xiao1，CAI Xin-rui2，ZHU Bao-lin3，QIAN Qiu-hai4，QIAN Wei-bin4

（1 .Traditional Chinese Hospital of Dezhou City，Dezhou 253000，China;

2 .Shandong Institute of Occupational Health and Occupational Diseases Prevention and Control，Jinan 250062，China;

3 .Peoples Hospital of Shizhong District of Jinan City，Jinan 250002，China;

4. The Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250011，China）

【Abstract】Objective：To observe the effect of TCM compound Jiarongkang on InhBP expression in ovarian tissue from hypothyroidism and hypogonadism rats and discuss its mechanisms，which is originally aimed to nourish spleen，kidney，liver and bone marrow with alleviating diarrhea Methods：The rat model of hypothyroidism was established by orally administering tapazole and these hypothyroidism rats were divided into 5 groups（n=10 each）：the model control group，the western medicine control group，the Jiarongkang group with low，medium and high doses，additionally the blank control group included All of medications were given orally After 6 weeks of intervention，the expression of InhBP in ovarian tissues was detected by immunohistochemistry Results：The InhBP expression in ovarian tissues from hypothyroidism rats was significantly increased Jiarongkang significantly reduced the expression of InhBP in ovarian tissues in the hypothyroidism rats In addition，the therapeutic effect was more significant with the increase of dose，significantly better than that of the other control groups with tapazole administration Conclusion：Abnormal InhBP expression is one of the mechanisms in hypothyroidism combined with hypogonadism Early intervention of hypothyroidism plus hypogonadism can be effective by nourishing spleen，kidney，liver and bone marrow with attenuating diarrhea Jiarongkang possibly reduces the abnormal expression of InhBP in ovary tissues from the model rats，which plays a protective role in thyroid gland and gonadal function，and remains to be studied

【Key words】Jiarongkang，hypothyroidism，hypogonadism，InhBP，immunohistochemistry

甲状腺功能减退症（hypothyroidism），是指由于甲状腺合成甲状腺激素减少或组织对甲状腺激素抵抗，引起血清甲状腺激素缺乏或作用发生障碍而表现出的一组临床综合征[1]。近年来，甲状腺疾病的发生率呈逐年上升趋势，且随年龄的增长而增加[2]。本病女性显著高发，男女发病比例为1：4-5。临床甲减的患者中，男性占01%，女性占19%;亚临床甲减患病率增高，男为27%，女为71%[3]。本文通过建立甲减合并性腺功能减退大鼠实验模型，观察甲荣康对大鼠卵巢组织InhBP免疫组化表达水平的影响。

1 實验材料

1.1.实验动物健康雌性wistar大鼠，体重（200±20）g，由山东中医药大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（鲁）20110003。普通饲料由山东中医药大学实验动物中心提供。总热量为15355J/g（蛋白质20%、碳水化合物53%、脂肪9%）。

1.2.药品及试剂甲荣康，由山东中医药大学附属医院药剂科加工而成，由炙黄芪、仙灵脾、巴戟天、仙茅、鹿角胶、肉桂、熟大黄、香附、郁金、当归、荷叶、干姜、白术等药物组成，实验时制成甲荣康水煎剂。优甲乐（左旋甲状腺素钠片），50 ug/片，Merck Gmbh公司生产，进口药品注册证号：H20100523，产品批号：146548。用研钵把药品研碎，与生理盐水配成悬浊液。他巴唑（甲巯咪唑），片剂，50 mg/片，北京市燕京药业有限公司生产，产品批号：H11020440，生产批号：120108。用研钵把药品研碎，与生理盐水溶液。一抗Rabbit Anti-inhBP，由北京博奥森生物技术有限公司提供（bs-9194R）;羊抗鼠/兔二抗检测试剂盒，由上海太阳生物提供，产品批号：DD13E001;浓缩型DAB试剂盒，由上海太阳生物提供，产品批号：100E005。

1.3.实验仪器电子天平，上海天平仪器厂;日本OLYMPUS CKX41-32PH型显微镜;德国Leica ASP全自动生物脱水机;德国Leica ASP2135型超薄切片机;Galanz微波炉;同济医科大学HPLAS100型医学影像分析系统。

2 实验方法

2.1.造模方法将Wistar大鼠适应性喂养3 d。采用抗甲状腺药物的造模方法，药物剂量按实验动物与人体表面积比换算而成，即200 g大鼠所需剂量相当于成人量×0018，具体给药：造模大鼠每日灌服004%他巴唑混悬液135 mL（054mg/200 g），共给药7周。

2.2.分组及给药将50只造模成功的大鼠随机分为以下5组（n=10）：①模型动物+生理盐水组 ②模型动物+优甲乐组 ③模型动物+甲荣康小剂量组 ④模型动物+甲荣康中剂量组 ⑤模型动物+甲荣康大剂量组。其中，模型动物+生理盐水组和正常动物+生理盐水组给予等容积生理盐水灌胃。模型动物+甲荣康小剂量组给予甲荣康水煎剂125 g/kg;模型动物+甲荣康中剂量组给予甲荣康水煎剂25 g/kg;模型动物+甲荣康大剂量组给予甲荣康水煎剂50 g/kg，模型动物+优甲乐组按照36ug/kg给药。每组均每日灌胃1次，给予普通饲料喂养，连续给药观察6周。

2.3.组织标本的采集解剖全部大鼠，迅速分别摘取每只大鼠卵巢，去除其周围的脂肪组织，用生理盐水冲洗后置4%甲醛中固定，待测InhBP免疫组化表达。

2.4.免疫组化方法检测卵巢组织InhBP的表达按照Rabbit SP Kit免疫组化染色试剂盒要求操作。显微镜下取10×10视野下观察标本，照相。每张切片镜下随机选取5个视野观察阳性产物的分布、染色情况。对每例切片，按Ferrier所采取半定量积分法[4]判断结果。

3 统计学方法

所有数据以（x±s）表示，采用SPSS 170统计软件，应用Students t检验，单因素方差分析，以P<005为差异有统计学意义。

4 实验结果

免疫组化结果显示：InhBP主要分布于大鼠卵巢组织，阳性反应产物分布于颗粒细胞中。InhBP在各组大鼠卵巢组织细胞中均有不同程度的表达，在模型动物+生理盐水组中InhBP阳性颗粒较少，着色较浅，表达不明显;而在模型动物+甲荣康小、中、大三个剂量组中，随着甲荣康应用剂量的增高，InhBP阳性颗粒增多，着色变深，且呈现一定的剂量相关性。模型动物+优甲乐组与模型动物+生理盐水组相比InhBP阳性表达较强，但明显少于模型动物+甲荣康大剂量组。见图1。

InhBP免疫组化表达的影响（×100）InhBP免疫组化阳性评分结果显示：模型动物+生理盐水组卵巢组织InhBP免疫组化阳性积分明显低于正常动物+生理盐水组（P<005）;模型动物+甲荣康小、中、大剂量组与模型动物+生理盐水组相比，InhBP阳性积分明显升高（P<005），并呈现出一定的剂量相关性，模型动物+甲荣康大剂量组与模型动物+优甲乐组相比也有明显差异（P<005）。模型动物+优甲乐组InhBP免疫组化阳性积分较模型动物+生理盐水组较高（P<005），但低于模型动物+甲荣康大剂量组（P<005）。见表1。

5 讨论

甲状腺功能减退症（甲减）是多种原因引起的甲状腺激素合成、分泌或生物效应不足所致的一组内分泌疾病，在我国临床甲减的患病率约为1%，各年龄段均可发病，女性居多，亚临床甲减的患病率为091%-605%，超过60岁的妇女中患病率可达20%[5]。甲减正日益成为威胁国人健康的隐形杀手。中医上甲状腺功能减退症可归属于虚劳、水肿的范畴。近年来运用中医药治疗本病报道日益增多，中医治疗甲状腺功能减退症在临床研究、实验研究也取得一定进展。随着甲减患病率的不断增长，选用甲荣方治疗甲减，因此，及早的发现甲减并做到有效的防治，即通过对甲减的早期干预，从而提高甲减患者的生活质量具有重大的意义。

现代医学研究表明，INHB（抑制素B）是排卵前抑制素的主要形式，主要由卵巢颗粒细胞、卵泡膜细胞合成分泌，对垂体合成和释放FSH（卵泡刺激素）起负反馈调节作用，并且能直接刺激卵泡膜细胞合成雄激素[6]。INHB可以作为反映发育中的卵泡功能的指标，且可反映卵巢的储备功能。研究发现，卵巢储备功能处于衰退中的妇女，其月经周期第3天血清INHB降低，血INH的下降是围绝经期出现最早的生化指标，可以直接反映卵巢的储备功能[7]。有两种蛋白被认为是具有代表性的INHR（抑制素受體），即inhBP（抑制素结合蛋白）和β-多糖，inhBP最初由Chong等[8]从牛垂体中提取，目前在人垂体促性腺激素细胞和卵巢、睾丸中也已证实其存在，其发挥作用的分子机制是：INH与inhBP结合后，其跨膜蛋白多糖与ACTRI（激活素受体I）交联，阻止ACTRI、ACTRⅡ之间联系，使ACTRI不能磷酸化，从而阻断激活素信号向细胞核内传导。另有观点认为，inhBP不能以受体常规的形式结合抑制素，因此认为[9]，这种蛋白只能促进抑制素与激活素竞争结合Ⅱ型受体，而不是产生特异的细胞内抑制素传导信号，即如果抑制素与激活素通过竞争形式结合受体，那么inhBP可提高其亲和力。从而发挥INHB拮抗ACTA的作用，降低对FSH的反应性，继而调节卵泡生长、优势选择。甲减女性患者往往伴随卵巢功能的减退，根据INHB及inhBP发挥作用的机制，我们推测，甲减时inhBP的异常表达降低了卵巢功能。

研究结果显示，甲减时卵巢组织InhBP数目明显增多，阳性表达增高，模型动物+生理盐水组与正常动物+生理盐水组相比有明显差异（P<001）。经灌服甲荣康6周后，模型动物+甲荣康小、中、大剂量组的InhBP阳性表达显著减弱，与模型动物+生理盐水组相比有显著性差异（P<001）。且模型动物+甲荣康大剂量组与模型动物+优甲乐组相比，也有明显差异（P<005）。实验表明InhBP表达水平增高可能是甲减导致性腺功能减退的原因之一。

参考文献：

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