利格列汀对2型糖尿病SD大鼠肾脏PRMT1表达及肾功能的影响*

梅 希，吴锦林，黎 瑶，邱 平

(1.成都医学院第一附属医院内分泌与代谢病科，成都 610500；2．重庆市中医院/重庆市中医研究院内分泌与代谢病科 400021)

目前，糖尿病肾病(DN)的发病机制仍没有完全阐明，现在公认的主要机制有：肾脏血流动力学改变、高血糖诱导的终末糖基化产物堆积、氧化应激和炎性反应等。既往关于氧化应激方面的研究已证实，糖尿病、高血压患者存在血管内皮功能障碍，其血清中非对称性二甲基精氨酸(ADMA)水平明显升高。约85%的ADMA主要由蛋白质精氨酸甲基转移酶1(PRMT1)催化生成，约75%的ADMA则由二甲基精氨酸二甲胺水解酶1(DDAH1)水解，即形成1条PRMT1-ADMA-DDAH1代谢轴[1-2]。既往研究证明这条代谢轴存在于糖尿病患者胰腺、眼及肾脏组织中[3-5]。二肽基肽酶-4(DDP-4)抑制剂是目前临床上使用的一种新型降糖药物，其主要作用机制是通过抑制胰高糖素样肽-1的分解，从而促进胰岛β细胞对胰岛素的释放。在众多DPP4抑制剂中，利格列汀由于其对肝肾功能影响小，且能控制体质量增加，所以广泛用于糖尿病的降糖治疗中。既往已有研究证实，在替米沙坦治疗基础上加用利格列汀可有效减少DN患者的蛋白尿。为此推测利格列汀除降糖作用外，还可能具有保护肾脏的作用。另外，利格列汀对肾脏中PRMT1的影响少见相关报道。本研究建立2型糖尿病伴早期DN的大鼠模型，通过单用利格列汀干预治疗，探讨其能否通过抑制PRMT1而起到保护肾功能的作用，现报道如下。

1 材料与方法

1.1材料 30只清洁及体质量为(170.30±10.09)g的雄性SD大鼠，购于成都医学院动物实验中心，在基础饲料喂养和自由进水进食的标准环境中饲养并适应1周，随机分为观察组(n=20)和正常对照组(NC组，n=10)。观察组给予高糖、高脂饲料饲养，NC组给予普通饲料饲养。

1.2分组 4周后，分别在观察组和NC组SD大鼠腹腔内注射链脲佐菌素(STZ)溶液(STZ，30 mg/kg,Sigma公司)和相应体积的柠檬酸缓冲液。1周后分别经尾静脉采血检测空腹血糖(FBG)(标准：以禁食后血糖水平>7.8 mmol/L判定观察组2型糖尿病大鼠模型建模成功)。随机将观察组分为糖尿病组(DM组，n=10)和糖尿病利格列汀治疗组(LM组，n=10)。LM组以利格列汀[3 mg/(kg·d)，美国礼来公司]经口灌胃，相应剂量的蒸馏水给予NC组和DM组。12周后，收集24 h尿液，将大鼠隔夜禁食称重并经乙醚麻醉后，从腹主动脉留取血液并分离肾脏标本。

1.3方法

1.3.1相关指标检测和计算 采用葡萄糖氧化酶法测定FBG；采用放射免疫法检测空腹胰岛素(FINS)、肌酐(Cr)、24 h尿微量清蛋白(24 h mALB)及尿微量清蛋白肌酐比值(ACR)。胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)用[HOMA-IR=FINS×FBG/22.5]计算，FINS单位为mU/L，FBG单位为mmol/L。

1.3.2动脉血压测定 各组大鼠动脉血压测量采用无创大鼠鼠尾测压仪。保持大鼠处于安静清醒状态，放置鼠尾于37 ℃加热毯加热，测量舒张压(DBP)和收缩压(SBP)。

1.3.3反转录-聚合酶链反应(RT-PCR) 肾脏总RNA的提取用Trizol，其水平和纯度测定采用核酸蛋白仪。将RNA反转录成cDNA后进行扩增(试剂购自日本Takara公司)。PRMT1上游引物为：5′-GAG TTC ACC CGA TGC CAC AAG-3′，下游引物为：5′-TCC GGT AGT CGG TGG AAC AAG-3′，扩增产物大小为238 bp，退火温度为57 ℃。取产物加入2%琼脂糖凝胶中进行电泳后，采用BioRad GelDos200凝胶成像系统进行图片拍摄，光密度值采用Quantity One软件进行分析。

1.3.4蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测PRMT1蛋白的表达 将肾脏组织加入蛋白裂解液中置于冰上匀浆，提取总蛋白，其蛋白水平测定采用BCA法。将蛋白样品按常规方法加入配制好的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶中进行电泳后转至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，加入PRMT1(1∶2 000，美国Cell Signaling公司)经4 ℃孵育过夜后用磷酸盐缓冲液洗膜，经1 h室温孵育二抗后再次洗膜，加入电化学发光试剂后采集图像(BioRad 成像系统)，分析光密度值(Quantity One软件)。

1.3.5免疫组织化学法 常规脱蜡并进行抗原热修复，按说明书进行一抗，在37 ℃下孵育2 h，经4 ℃过夜后标记二抗(用DAB显色)，苏木精复染、脱水并用中性树脂封片，并于光镜下观察阳性细胞(细胞内出现棕黄色颗粒)进行图像分析，计算光密度值(Image-Pro Plus软件)。

2 结 果

2.1各组大鼠相关指标比较 见表1、2。DM组大鼠FBG水平较NC组明显升高，LM组与DM组比较明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；与NC组比较，DM组及LM组大鼠体质量、SBP、DBP、FINS、HOMA-IR、Cr、ACR及24 h mALB水平明显升高，而LM组较DM组明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。

2.2各组大鼠肾脏组织中PRMT1的mRNA表达比较 见图1。与NC组比较，DM组及LM组大鼠肾脏组织中PRMT1的mRNA表达明显升高，差异均有统计学意义(P<0.01)；而LM组的表达较DM组明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3各组大鼠肾脏组织中PRMT1蛋白表达比较 见图2。与NC组比较，DM组及LM组大鼠肾脏组织中PRMT1蛋白表达明显升高，而LM组的表达较DM组明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。

2.4各组大鼠肾脏免疫组织化学法结果比较 见图3。NC组大鼠肾小管上皮细胞核内可见少量阳性细胞，DM组有大量阳性细胞，LM组也可见部分阳性细胞，介于NC组与DM组之间。NC组平均光密度值低于DM组及LM组，LM组光密度值低于DM组，差异均有统计学意义(P<0.05)。

表1 各组大鼠生化指标检测结果比较

注：与NC组比较，*P<0.05；与DM组比较，#P<0.05

表2 各组大鼠生理指标检测结果比较

注：与NC组比较，*P<0.05；与DM组比较，#P<0.05

注：与NC组比较，*P<0.01；与LM组比较，△P<0.05

图1大鼠肾脏组织中PRMT1的mRNA表达

注：与NC组比较，*P<0.01；与LM组比较，△P<0.05

图2大鼠肾脏组织中PRMT1蛋白表达

注：与NC组比较，*P<0.01；与LM组比较，△P<0.05

图3各组大鼠肾脏PRMT1蛋白表达免疫组织化学结果(HE，×400)

3 讨 论

利格列汀属于DPP4抑制剂，15%左右以原型经肾脏排泄，85%左右经粪便排出，故其不良反应少，肝肾功能不全者无需调整剂量，在众多DPP4抑制剂中有独特优势。本研究以糖尿病SD大鼠模型作为研究对象，采用利格列汀干预治疗12周，结果显示该药除明显降糖作用外，还能降低其肾脏组织中PRMT1的表达，明显减少24 h mALB及ACR，降低血Cr及血压水平，提示利格列汀有肾脏保护作用，可能与下调肾脏组织中PRMT1的表达有关，推测其机制可能有以下几方面。

3.1抑制氧化应激 DPP4抑制剂对肾脏功能的保护作用机制可能与抑制氧化应激有关，相关研究也发现，DPP4抑制剂能够预防和改善心脏和肾脏组织的氧化应激状态[6]。PRMT1-ADMA-DDAH1通路在糖尿病的氧化应激中起重要作用。PRMT1的表达在糖尿病高氧化状态下升高，而DDAH1的表达却下降，导致ADMA水平升高。有研究发现，PRMT1-ADMA-DDAH1通路在糖尿病大鼠的多个器官，如胰腺、肾脏及眼中均表达失衡[3-5]。本研究发现，通过利格列汀干预治疗后，糖尿病大鼠肾脏组织中PRMT1 mRNA及蛋白表达均明显降低，证实了利格列汀对PRMT1-ADMA-DDAH1通路关键蛋白的调节作用，提示其具有抗氧化应激效应，与近期研究结果相似[7]。但本研究未对该轴其余2个分子的水平进行检测，后续研究可围绕利格列汀作用于PRMT1相关通路展开进一步研究。

3.2改善血流动力学和抑制血管增生 正常肾动脉呈高速低阻的血流动力学特点，随着糖尿病病情进展，受损血管内皮细胞不断增生，加重血管管腔的狭窄和闭塞。目前认为，ADMA升高可能是糖尿病患者导致血管内皮功能失调的主要机制。DPP4抑制剂可抑制血管增生，改善血管内膜与中膜比率及肾动脉血流动力学，抑制肾脏纤维化及血管内皮增生，从而达到肾脏保护作用[8-9]。本研究显示，通过利格列汀干预治疗后，糖尿病大鼠肾小管上皮细胞核中PMRT1表达明显降低，且SBP、Cr水平均下降。本研究推测这是由于利格列汀通过降低肾小管上皮细胞核中的PRMT1水平，抑制ADMA表达，从而减轻对血管内皮功能的损伤，加上利格列汀对血压的改善，减轻了DN状态下高阻低速的血流动力学改变，从而降低Cr水平。本研究未检测血流动力学及内皮细胞的相关指标，这是本研究的不足之处。

3.3减轻胰岛素抵抗及减少尿蛋白 早期研究发现，ADMA升高伴随胰岛素抵抗发生，而胰岛素抵抗是糖尿病和高血压的共同发病基础[10]。本研究发现，通过利格列汀干预治疗后，大鼠体质量明显下降，胰岛素抵抗明显改善，血糖得到较好控制。本研究推测，除DPP4抑制剂本身通过肠促胰岛素途径降低血糖外，利格列汀也可通过对PRMT1-ADMA-DDAH1轴的影响，改善胰岛素抵抗，从而改善血糖水平。另外，DPP4抑制剂还有降低DN患者尿蛋白及改善肾脏功能的作用[11]。本研究结果提示，利格列汀单药治疗12周后可明显减少糖尿病大鼠24 h mALB、ACR及血Cr水平。作者推测，血糖降低本身可从一定程度上改善肾功能和蛋白尿，但利格列汀除降糖机制的降尿蛋白作用外，还对肾功能起到一定保护作用。

综上所述，利格列汀可以通过对糖尿病大鼠肾脏中PRMT1表达的影响，起到改善氧化应激、抑制血管增生、改善肾脏血流动力学、缓解胰岛素抵抗和减少尿蛋白等作用，在一定程度上延缓和改善了DN的发生和发展。