4-PBA通过抑制内质网应激减轻原代海马神经元的损伤*

柳秀平， 吕凌云， 李夏春

(1杭州市中医院检验科， 浙江 杭州 310007; 2三峡大学医学院病理生理教研室， 湖北 宜昌 443002)

阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)是一种以进行性认知障碍和记忆功能损害为主的中枢神经系统退行性疾病，主要病理特征是老年斑和神经原纤维缠结，同时伴有突触丢失，树突棘和突触蛋白的损伤[1]。目前AD发病机制有多种假说，内质网应激学说认为受基因、环境和年龄等因素的影响，AD 神经元中内质网(endoplasmic reticulum，ER)错误折叠蛋白质增多，ER内稳态失衡引起ER应激(ER stress)，进而激活凋亡途径引起神经细胞凋亡可能与AD发病密切相关[2]。研究发现在SD大鼠中ER应激能促进tau蛋白磷酸化及突触蛋白的丧失[3], 侧脑室注射衣霉素(tunicamycin，Tm)可诱导大鼠空间记忆障碍[4]，因此我们可以通过抵抗内质网应激来减轻神经元损害。由此寻求一种具有抵抗内质网应激作用，预防神经元受损害的药物显得尤为必要。

4-苯基丁酸(4-phenylbutyric acid，4-PBA)是一种具有分子伴侣作用的短链芳香族脂肪酸，它可以逆转蛋白质分子的错误移位和错误聚集并帮助其建立正常的空间结构，从而具有抗内质网应激和诱导分化的作用[5]。化学伴侣 4-PBA 能够减缓用衣霉素和毒胡萝卜素诱导传代细胞产生的ER应激[6]。在 Tg2576 小鼠中也发现，4-PBA 能够在AD病理形成前阻止β-淀粉样蛋白(amyloid β-protein, Aβ)形成，减少突触丢失及认知障碍[7]。目前4-PBA对原代神经元细胞ER应激的作用尚未明确。本研究中，我们在培养的原代神经元建立内质网应激模型，发现内质网应激降低原代神经元树突棘密度和突触蛋白表达量，而4-PBA抑制内质网应激，减缓原代海马神经元的突触蛋白丢失和树突棘密度下降，这为预防治疗阿尔茨海默病等神经变性疾病提供了新的线索。

材 料 和 方 法

1 主要试剂和质粒

4-PBA、MTT和二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide， DMSO)购自Sigma；衣霉素购自Alexis Biochemical；原代培养试剂(包括DMEM、神经培养基、F12和B27)和转染试剂Lipofectamine均购自Invitrogen；兔抗免疫球蛋白重链结合蛋白(immunoglobulin heavy chain-binding protein, BiP)多克隆抗体和鼠抗α-微管蛋白(α-tubulin)单克隆抗体购自Abcam；兔抗突触小泡蛋白(synaptophysin， Syp)多克隆抗体购自Sigma；兔抗突触后致密蛋白95(postsynaptic density protein 95, PSD95)多克隆抗体购自Cell Signaling Technology；表达增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)的质粒购于上海纽恩生物公司。

2 主要方法

2.1原代海马神经细胞的培养 取孕新生大鼠，麻醉消毒取出完整脑组织，游离出双侧海马组织，剥离脑膜及血管膜。将海马置入解剖液(含3%～6% 葡萄糖的D-Hanks液)并剪碎(以上均在冰上进行)，0.125% 胰蛋白酶(GIBCO)37 ℃消化8 min(可以根据消化程度而调整)，加入种植培养液(DMEM/F12+10%胎牛血清+0.5%双抗)终止消化，滴管吹打后经200目筛网滤过，1 500 r/min离心5 min, 去上清，加入适当的种植培养液重悬，依实验目的调整细胞密度，接种于预先用多聚赖氨酸包被的培养板、培养瓶或者玻片中，置CO2培养箱内(37 ℃、5% CO2)培养；4 h后全量换成维持培养基(95% Neurobasal+2% B27+0.2%谷氨酰胺+0.5%青链双抗),以后每3 d半量换液，培养20 d。

2.2Western blot检测内质网应激标志蛋白及突触蛋白的表达 提取细胞蛋白，BCA法进行蛋白定量，将等量的蛋白利用SDS-PAGE分离并转移到硝酸纤维素膜上，封闭，加入相应I抗， 4 ℃孵育过夜后洗膜加入标记荧光素的的羊抗兔或羊抗鼠II抗，最后用Odyssey远红外成像系统扫描识别蛋白印迹并定量分析。

2.3培养神经元的转染与荧光显微镜成像 采用Invitrogen公司的转染试剂Lipofectamine 2000, 在海马神经元种植后5～7 d [DIV (dayinvitro) 5～7]转染表达EGFP的质粒。将DIV 20转染EGFP的原代海马神经元分为3组: DMSO组、TM(3 mg/L)组和TM(3 mg/L)+4-PBA(1 mmol/L)组(4-PBA提前1 h加入)。将所用药物加入到细胞培养液中，继续在37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h后，21 d神经元成熟用多聚甲醛固定，在双光子共聚焦显微镜下观察树突棘的变化。

2.4Tm和4-PBA对神经元细胞活力的影响 原代海马神经元种植于96孔板，DIV20用不同浓度Tm处理24 h或4-PBA处理25 h或4-PBA预处理1 h再加入Tm处理24 h后加入PBS清洗后加入MTT(5 g/L)溶液于无血清DMEM培养基中孵育3 h，轻轻吸去培养基，加入DMSO溶解甲臜，用酶标仪 (BioTek) 在560 nm波长测定吸光度(A)值。以各组吸光度与DMSO组吸光度的百分比值表示各组的细胞活力。

3 统计学处理

采用SPSS 12.0统计软件进行统计分析，计量资料用均数±标准差(mean±SD)表示；采用Image-Pro Plus软件统计突触数目，多组间比较采用单因素方差分析，各组均数间的两两比较采用SNK-q检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 4-PBA减弱 Tm诱导的原代神经元内质网应激

首先用Tm诱导ER应激,通过检测细胞中BiP的蛋白水平来反映内质网应激。我们选取了2个不同浓度的Tm, Western blot结果显示, 3 mg/L和10 mg/L的Tm处理后，原代神经元中的BiP蛋白水平均明显升高(P<0.05)，见图1A，说明Tm使原代神经元细胞发生明显的内质网应激，由于3 mg/L Tm已经诱导明显内质网应激，因此后续实验我们选择3 mg/L Tm。提前1 h加入不同浓度的4-PBA预处理，结果显示细胞中的BiP蛋白水平与处理组相比显著下降(P<0.05)，在浓度为1 mmol/L和5 mmol/L时效果明显，见图1B，说明Tm诱导原代海马神经元发生内质网应激，4-PBA可减轻Tm诱导的内质网应激。

Figure 1.Tm induced ER stress in the primary hippocampal neurons and 4-PBA reduced the level of BiP after Tm exposure. A: the images of Western blot and quantitative analysis for determiming the protein expression of BiP normalized by α-tubulin in the primary hippocampal neurons treated with Tm (3 and 10 mg/L); B: the images of Western blot and quantitative analysis for determiming the protein expression of BiP in the primary hippocampal neurons exposed to 3 mg/L Tm with or without 4-PBA pretreatment. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs DMSO group; #P<0.05 vs Tm group.

2 4-PBA抑制Tm诱导的原代神经元细胞树突棘密度降低

DIV 5～7的原代神经元经EGFP转染后培养到DIV 20,分组给药24 h后荧光显微镜下可观察到原代神经元细胞树突棘。我们的结果显示Tm诱导24 h后海马神经元树突棘密度与对照组相比明显减少，而1 mmol/L 4-PBA预处理组的树突棘密度显著升高(P<0.05)，见图2。这说明Tm诱导树突棘密度下降，4-PBA可抑制Tm诱导的树突棘密度降低。

3 4-PBA抑制Tm诱导的原代神经元细胞突触蛋白表达下降

用Western blot法检测突触相关蛋白的蛋白含量，结果发现Tm诱导24 h后海马神经元突触前蛋白Syp及突触后蛋白PSD95的蛋白水平下降，而1 mmol/L 4-PBA预处理组可使这2种突触蛋白的表达水平上升(P<0.05)，见图3。说明Tm诱导突触蛋白表达下降，4-PBA可抑制Tm诱导突触蛋白表达下降的作用。

Figure 2.Tm reduced the dendritic spine density of primary hippocampal neurons and 4-PBA increased the dendritic spine density after Tm treatment. A and B: dendritic spine density after Tm exposure was detected by laser confocal microscope; C: the quantitative analysis of A (16, 18 and 19 dendrites were analyzed in DMSO group, Tm group and Tm+4-PBA group, respectively). Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs DMSO group; #P<0.05 vs Tm group.

Figure 3.The levels of BiP and synaptic proteins measured by Western blot. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs DMSO group; #P<0.05 vs Tm group.

4 4-PBA减轻Tm对原代神经元细胞活力下降的影响

用MTT分析4-PBA和Tm对原代神经元细胞活力的影响，结果发现0.01、 0.1、 1和5 mmol/L 4-PBA单独处理25 h细胞活力均无显著变化； Tm(3 mg/L)和Tm(10 mg/L)处理原代神经元24 h, 3 mg/L Tm引起神经元活力轻度降低(84.29%±2.25%vs100%,P<0.05)， 10 mg/L Tm引起神经元活力显著降低(66.5%±3.5%vs100%,P<0.05);用上述各浓度4-PBA预处理1 h后再加入Tm 3 mg/L处理24 h, 发现0.1、 1和5 mmol/L 4-PBA预处理1 h后再用Tm处理24 h细胞活力明显改善(P<0.05)，见图4。这些结果提示4-PBA可显著改善低浓度Tm处理引起的细胞活力降低。

讨 论

AD是一种以进行性、海马依赖性记忆和认知功能障碍为主的中枢神经系统退行性疾病。脑突触功能障碍在AD疾病进展机制中占有重要地位，突触的数量和功能的改变可引起突触可塑性的改变，进而影响学习记忆能力，与疾病认知功能障碍明显相关。近年来有研究发现，内质网应激可能与突触功能障碍密切相关。

Figure 4.The effects of Tm and 4-PBA on viability of primary hippocampal neurons detected by MTT assay. A: the effect of Tm on cell viability was detected by MTT assay; B: the effect of 4-PBA on cell viability was by MTT assay; C: the effect of 4-PBA on cell viability reduction induced by Tm was by MTT assay. Mean±SD. n=10. *P<0.05 vs DMSO group; #P<0.05 vs Tm group.

内质网是真核细胞中最重要的细胞器之一，是脂类和固醇合成、维持 Ca2 +动态平衡、蛋白质合成与折叠及其翻译后修饰的场所，其功能紊乱则引起内质网应激，造成一系列细胞反应，参与多种神经退行性疾病的发生发展[8]。AD的一个显著特征是错误折叠蛋白的积累[9]。已有报道内质网应激与AD 患者学习记忆障碍有密切关系。神经元发生内质网应激时，不仅会引起神经细胞一系列形态生理功能的变化，如Ca2+代谢紊乱导致神经元产生兴奋性毒性和使突触丢失、记忆损害[10]以及导致PS 突变和Aβ沉积[11]、抑制反应元件和蛋白因子的结合阻止记忆形成[12]。因此研究神经元内质网应激的作用机制对于了解 AD学习记忆障碍发病机制以及治疗AD具有重要意义。

据报道学习记忆障碍患者在神经元凋亡之前就能观察到突触丢失和突触功能异常[13]。神经元间的通信主要发生在突触，其中包括突触前成分、突触间隙和突触后成分。树突棘是树突分支上常见的棘状兴奋性突触，这种棘状小突起是神经元之间形成突触联系的主要部位，是突触后成分主要组成部分。学习记忆过程常与树突棘的形成、脱落、扩张和萎缩等形态以及数目和组成相关，并且突触相关蛋白对其功能的发挥起着决定性作用，突触相关蛋白在学习和记忆中扮演着重要角色[14]。因此我们推测，诱导内质网应激时大鼠学习记忆障碍与树突棘密度降低及与学习记忆相关的突触蛋白的表达下降有关。我们用Tm处理原代海马神经元24 h后，发现其表达 BiP 蛋白水平明显升高，树突棘密度和突触相关蛋白表达下降;同时我们发现在Tm处理1 h前给予4-PBA 预处理，BiP的表达较Tm组明显下降，树突棘密度和突触相关蛋白表达增加,这说明Tm引起了明显的内质网应激和树突棘密度和突触相关蛋白下降，4-PBA预处理显著减轻内质网应激和树突棘密度和突触相关蛋白下降。因为树突棘密度和突触相关蛋白的表达也受线粒体密度和功能的影响，所以我们也用MTT检测细胞活力来反映线粒体密度和功能，结果显示Tm(3 mg/L)处理只轻度降低细胞活力，不同浓度4-PBA单独使用不改变细胞活力，但是用4-PBA预处理可减轻Tm引起的细胞活力轻度降低,这说明低浓度Tm引起显著内质网应激是导致树突棘密度下降和突触相关蛋白表达下降的主要原因。最近也有研究报道Tm可在SD大鼠引起以寻找新目标潜伏期延长为主的认知功能障碍，并且可引起树突棘密度显著下降，树突头部直径变小，海马长时程增强减弱，GluR1表达水平显著下降[15]。4-PBA 是一种短链芳香族脂肪酸，有报道发现用衣霉素、毒胡萝卜素诱导细胞产生内质网应激，加入分子伴侣 4-PBA 能够减缓内质网应激[6]。最近的研究发现4-PBA可减轻原代背根神经结神经元高糖血症诱导的氧化应激和细胞凋亡，但并不改变细胞活力和钠通道的表达[16]。在 Tg2576 小鼠, 也发现4-PBA 能够在AD病理形成前阻止Aβ形成，减少突触丢失及认知障碍[7],这些结果都表明 4-PBA 主要可能通过降低Tm引起的神经元内质网应激，增加树突棘密度和突触相关蛋白表达，起到减轻原代海马神经元损伤的作用。

综上所述，我们的研究证实在原代海马神经元内质网应激使树突棘密度和突触相关蛋白表达下降，而4-PBA预处理可显著抑制内质网应激诱导的树突棘密度下降和突触蛋白表达量下降，减轻原代海马神经元损伤。因此，4-PBA作为一种内质网应激的抑制剂，有望作为一种新型的靶点来治疗阿尔茨海默病。