超高效合相色谱法测定鱼肝油中维生素D3含量

陈 虹， 杨桂秋， 吴文杰， 吴寒秋， 程 燕

(1.沈阳化工大学 制药与生物工程学院， 辽宁 沈阳 110142； 2.中国检验检疫科学院食品安全研究所， 北京 100176)

鱼肝油是一种从鲛类动物Squahdae等无毒海鱼肝脏中提出的一种脂肪油[1]，其中维生素D3是鱼肝油中主要的营养物质之一.维生素D3有助于促进小肠粘膜对钙的吸收，能够预防佝偻病和骨样组织钙化障碍等疾病[2-3]，然而，维生素摄入过量也导致健康风险[4].因此，测定鱼肝油维生素对评价鱼肝油品质优劣、合理使用鱼肝油具有现实意义.

脂溶性维生素的检测有很多种方法：液相色谱法[5-6]、液相色谱串联质谱法[7-9]、分光光度法[10]、毛细管电动色谱法[11]等.最常见的检测鱼肝油中维生素D3含量的方法主要是液相色谱法.液相色谱法与分光光度法比较优势在于可以对复杂基质样品进行在线分离并定量定性，能排除样品基质中部分干扰.液相色谱法相比于液相色谱串联质谱法而言仪器设备经济实惠，操作和仪器维护相对简单，可以满足本实验对目标物的检出限和精密度检测要求.食品中维生素的检测主要依据《GB 5413.9—2010食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中VA、VD、VE的测定》[12].然而国标中试样经皂化后用石油醚提取，用正相色谱净化，反相色谱分离，外标法定量.该方法操作复杂，耗时长，而且干扰物质较多，容易造成维生素被破坏，导致回收率下降.

文献报道正相色谱检测鱼肝油中的维生素D3前处理简单[13]，能够简化操作步骤.waters超高效合相色谱(UPC2)是2012年面世的新型正相色谱，它具有传统高效液相色谱和超临界流体色谱的优点[14]，以二氧化碳为流动相主体，依靠CO2的溶剂化能力对目标物进行分离、分析[15]，具有有机溶剂使用量少、分析速度快、重现性好等优点[16-17].合相色谱作为一种新技术能够完全替代正相液相色谱，合相色谱分离成本仅为液相色谱的十分之一；其灵敏度比正相液相色谱高，分离效果更好，分析速度快，能够分离液相色谱难以分开的同分异构体组分，还能分析传统液相色谱难保留或难洗脱的成分(比如多糖).合相色谱与气相色谱相比，当分析挥发油、油脂类样品时，合相色谱能简化前处理步骤，避免了衍生化，大大提高了检测效率.目前国内没有应用超高效合相色谱检测鱼肝油基质中维生素D3含量的文献报道.本文采用超高效合相色谱法测定鱼肝油中维生素D3含量，样品经正己烷提取后上样，能够大大简化样品预处理步骤，缩短分析时间，具有预处理简单、耗时短、灵敏度高、回收率高等优点，为复合鱼肝油制剂的质量控制提供一种新方法.

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂、材料

Waters超高效合相色谱，美国 waters公司，检测波长设置为265 nm；Allegra X-22R 冷冻离心机，美国Beckman Coulter公司；VORTEX-5 涡旋混合器，海门市Kylin-Bell公司; 维生素D3，质量分数为98 %，德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司; 甲醇、乙腈、异丙醇、正己烷，色谱纯，美国Thermo Fisher 公司；6种鱼肝油样品，购于当地药店(中国，北京).

1.2 标准溶液的配制

标准储备液:准确称取维生素D310.0 mg，加入到10 mL容量瓶中，用正己烷定容到10 mL，待其完全溶解，配制成 1 g/L 的标准储备液，避光储存在-25 ℃冰箱中待用.

标准工作液：准确吸取5 mL、2 mL、1 mL、500 μL、200 μL、100 μL、50 μL、20 μL、10 μL标准储备液于10 mL 容量瓶中，用正己烷定容成质量浓度分别为500 mg/L、200 mg/L、100 mg/L、50 mg/L、20 mg/L、10 mg/L、5 mg/L、2 mg/L和1 mg/L 的标准工作液，置于棕色样品瓶，避光储存在-4 ℃冰箱中，平均每4 h重新配制一次.

1.3 超高效合相色谱条件

色谱柱:Waters Acquity UPC2Torus 1-AA(100 mm×3.0 mm，1.7 μm),流动相:A 为 CO2，B 为甲醇; 体积分数为80 %的CO2等度洗脱.采集时间3 min;流速 1 mL/min; 进样量 1 μL; 柱温 50 ℃ ; 检测波长 265 nm; 动态背压(ABPR):15.169 MPa.

1.4 样品处理

前处理参考相关文献[13]，采用正己烷直接提取稀释上样.准确称取 1.0 g鱼肝油样品于 50 mL 聚乙烯管中，加入 10 mL正己烷，用涡旋混匀后，高速冷冻离心机于 4 ℃ 下以7 500 r/min 离心 5 min，取 1 mL 上清液，经 0.22 μm 滤膜过滤后，经超高效合相色谱分析.

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

比较3种Waters Acquity UPC2常用色谱柱： Waters Acquity UPC2BEH(150 mm×2.1 mm，1.7 μm),Waters Acquity UPC2Torus 1-AA柱(100 mm×3.0 mm,1.7 μm) 和Waters Acquity UPC2Torus 2-PIC柱(150 mm×2.1 mm,1.7 μm).3种色谱柱都能在5 min内出峰完全.由表1可知：使用 BEH柱和2-PIC柱时，维生素D3的对称因子是1.57和1.71，峰面积分别为31 428和33 728；而使用1-AA柱时，维生素D3的对称因子是1.48，峰面积是30 240.对称因子越接近1 说明峰型越对称，峰型越好.由图1可知：当使用BEH和2-PIC柱时，维生素D3在1 min左右出峰，杂质峰通常在1 min之前出现.出峰过早容易与杂质一起出峰，在实际检测中影响检测结果，所以，使用BEH和2-PIC柱不合适.使用1-AA柱时，维生素D3在1.8 min左右出峰，目标物的峰与杂质峰、溶剂峰等能够很好地分开.综上所述，使用1-AA柱时维生素D3的响应更高，峰型更好，出峰时间更合适.因此，色谱柱选择Waters Acquit UPC2Torus 1-AA柱.

表1 不同色谱柱下维生素D3的峰面积和对称因子Table 1 Peak area and symmetry factors of vitamin D3 with different chromatographic columns

图1 不同色谱柱上维生素D3色谱图Fig.1 Chromatogram of vitamin D3 with different chromatographic columns

2.2 流动相中助溶剂的优化

CO2超临界流体作为超高效合相色谱的流动相，因为其极性过低，通常加入甲醇、乙醇、异丙醇和乙腈等有机溶剂作为助溶剂.助溶剂能够调整流动相极性，改变流动相对目标物的溶解能力，影响目标化合物的保留时间并改善目标化合物的峰型[18].比较4种常用助溶剂：甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈，考察助溶剂对维生素D3峰型及保留时间的影响，选择最优助溶剂.结果如图2所示.

图2 不同助溶剂下维生素D3色谱图Fig.2 Chromatogram of vitamin D3 with different solvents

不同助溶剂对维生素D3的峰型影响不大，但是对维生素D3的保留时间影响明显.当使用甲醇为助溶剂时，维生素D3在1.5～2 min 之间出峰；当使用助溶剂为乙醇、异丙醇和乙腈时，维生素D3的保留时间均大于2 min.因此，可以看出选择甲醇为助溶剂能节省分析时间，故最终选择甲醇为助溶剂.

2.3 系统背压的优化

系统背压是超高效合相色谱重要参数之一.其主要作用是控制流动相密度和性能，改变流动相的洗脱能力和性能[15]. CO2超临界流体的密度和黏度随着背压的增加而增加，会导致柱压升高[17]，所以，选择合适背压非常重要.考察了12.411 MPa、13.790 MPa、15.169 MPa和16.548 MPa 4种背压下CO2超临界流体对目标物保留时间和峰型的影响.结果如表2.由表2可知：当背压为12.411 MPa时，维生素D3的保留时间为1.24 min，对称因子为1.34;当背压为15.169 MPa时,维生素D3的保留时间为1.19 min，对称因子为1.19.通过比较保留时间和对称因子，可以看出当柱压为15.169 MPa时，虽然和其他条件相比维生素D3的出峰时间相差不大，但是维生素D3峰型更好；而当柱压为16.548 MPa时，色谱柱压力过高.通过对保留时间、峰型及色谱柱压力的综合考虑，最终选择背压为15.169 MPa.

表2 不同系统背压下维生素D3的保留时间和对称因子Table 2 Retention time and symmetry factors of vitamin D3 with different dynamic pressures

2.4 色谱柱温度的优化

温度也能够影响目标物的峰型和保留时间.在30 ℃、40 ℃、50 ℃下考察柱温对目标物分离的影响.结果表明：随着温度的变化，维生素D3的保留时间并没有明显差异，但是，当温度为 30 ℃时，柱压较高，基线噪音较大，重现性较差；当温度为40 ℃时，基线噪音有所减小；当温度为 50 ℃时，基线噪音减小，基线平稳，具有较好的重现性.所以，色谱柱最终温度选择 50 ℃.

2.5 流速的选择

流速是影响目标物峰型和保留时间的重要因素之一.随着流速的增大，目标物的出峰时间提前，峰型变得尖锐；但是流速过大容易造成柱压过高，影响峰型，缩短色谱柱的使用寿命.实验在 0.8 ～ 1.8 mL/min 范围内对流速进行优化.结果如图3所示.

图3 不同流速下的维生素D3色谱图Fig.3 Chromatogram of vitamin D3 with different flow velocities

当流速为1.8 mL/min、1.5 mL/min和1.2 mL/min 时，维生素D3的保留时间小于1 min，出峰时间过早，在检测样品时容易与杂质一起出峰，对样品中维生素D3含量的精确度造成干扰；当流速为0.8 mL/min 时，维生素D3的色谱峰过宽.综上所述，选择1 mL/min为最佳流速.

2.6 方法学考察

2.6.1 线性、检出限及定量限

选取500 mg/L、200 mg/L、100 mg/L、50 mg/L、20 mg/L、10 mg/L、5 mg/L、2 mg/L和1 mg/L的维生素D3标准工作液，按照优化好的最佳色谱条件进行测定，绘制样品质量浓度(x，mg/L) 与峰面积(y，mV ·s) 标准曲线，进行线性回归分析，结果如表3 所示.该方法在5 ～ 200 mg/L 时线性关系良好.检出限、定量限如表3 所示.

表3 维生素D3的线性回归方程、线性范围、 检出限、定量限Table 3 Linerregression,liner range,LOD,LOQ of vitamin D3

2.6.2 回收率和精密度

称取1.0 g的鱼肝油样品于离心管中，分别加入5 mg/kg、10 mg/kg，50 mg/kg的维生素D3标准工作液，静置一段时间后，样品经正己烷提取，过膜上机，在上述优化好的色谱条件下进样检测，计算其加标回收率.低、中、高3个加标水平分别重复测定6次，结果如表4.维生素D3在3个加标水平中回收率分别为87.4 %、90.7 %和89.3 % ，相对标准偏差(RSD) 为 3.2 %、1.0 %、0.3 %.

表4 回收率及精密度Table 4 Recovery and precision

2.6.3 实际样品检测

对6个不同品牌的鱼肝油样品进行分析，检测结果见表5. 由表5的结果显示： 不同品牌的鱼肝油中维生素D3的含量不同，这可能与鱼肝油原料的来源、处理、加工工艺等因素有关.

表5 不同品牌鱼肝油中维生素D3的含量Table 5 Content of six kinds of Cod Liver Oil and vitamin D3

3 结 论

建立了超高效合相色谱(UPC2) 对鱼肝油中维生素D3的检测方法，考查了色谱柱、助溶剂、系统背压、色谱柱温度、流速等因素，选定了最佳实验条件.该方法分析时间短，维生素D3在2 min出峰完全，实验步骤简单，安全环保，为鱼肝油中维生素D3的检测提供了技术支持，为鱼肝油的质量评价提供新方法.