罗勒总黄酮对ApoE-/-基因缺陷动脉粥样硬化小鼠NF-κB信号通路的调控作用

艾再提·克热木， 周文婷， 古再努尔·买买提， 阿布来提·阿布力孜， 阿迪力·萨吾提，阿瓦古丽·达吾提，艾合买提江·纳曼， 艾尼瓦尔·吾买尔

(新疆医科大学药学院药理教研室， 乌鲁木齐市 830011)

罗勒(OcimumbasilicumL.,OBL)为唇形科(Labiatae)罗勒属(Ocimum L.)植物[1]，具有疏风行气、化湿消食、抗凝血、解毒等药理作用，临床上多用于外感头痛、食胀气滞、脘痛、泄泻、月经不调、跌打损伤、蛇虫咬伤、皮肤湿疮、瘾疹痛痒等症的治疗[2-4]。动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是心血管系统疾病的病理基础，AS的发生和发展与慢性炎症密切相关。动脉血管壁增厚和硬化，血管腔变窄和弹性丧失是AS的主要病理特征，此外还有动脉内膜上黄色动脉粥样脂样脂质积聚，其主要累积在大中肌动脉中，并进展到阻塞动脉管腔阶段，这将导致动脉血供的组织或器官因缺血而坏死[5-7]。载脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠是研究AS干预措施和发病机制最理想的动物模型，并且是用于筛选抗AS药物[8]。核因子κB(nuclearfactor kappa B，NF-κB) 是对多项转录蛋白具有调节作用，它调整与AS形成、 发展有关的基因产物，如细胞因子、趋化因子、粘附分子和生长因子，这些因子对相关细胞的激活、增殖、浸润、趋化和分泌起直接的调整和控制作用[9-10]。本研究以ApoE小鼠动脉粥样硬化模型为基础，研究罗勒总黄酮对小鼠主动脉血管壁结构病理变化的影响，探究罗勒总黄酮通过影响NF-κB活化水平从而发挥防治AS的作用机制，现报道如下。

1 仪器与试药

1.1仪器BIO RAD型电泳仪(北京赛百奥科技有限公司)，Multiskan GO型酶标仪(美国Thermo公司)，XPN-100型低温台式超速离心机(德国 Eppendorf公司)。

1.2试药辛伐他汀(杭州默沙东制药有限公司，批号：R001828)，4%多聚甲醛(上海威奥生物科技有限公司，批号：1115B17)，RIPA裂解液(美国Sigma公司，批号：RF234939)，预染marker(美国Thermo公司，批号：00423206)，BCA浓度蛋白测试盒(素莱宝科技有限公司，批号：20171115)，蛋白酶抑制剂/磷酸酶抑制剂(美国Thermo公司，批号QD216061)，NF-κB抗体(美国Abcam公司，批号：ab16502)，磷酸化NF-κB抗体(美国Abcam公司,批号：ab28856)，ICOM-1抗体(美国Abcam公司，批号：ab171123)，VCAM-1抗体(美国Abcam公司，批号：ab137047)，磷酸化 IκBα抗体(美国CST公司，批号：ser32)，IκBα抗体(美国Abcam公司，ab7217)，β- actin蛋白 (美国Abcam公司，批号ab8227) 。

1.3药材罗勒全草2016年9月份采集于新疆吐鲁番托克逊县，经新疆医科大学药学院天然药物化学与生药教研室帕丽达·阿布力孜教授鉴定为唇形科(Labiatae)罗勒属(OcimumL.)罗勒(OcimumbasilicumL.)的全草。

1.4试验动物取6 w龄ApoE-/-雄性小鼠50只，6 w龄C57BL/6J雄性小鼠10只，体质量(20±3)g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证号：NO11400700210013，使用许可证号SCXK(京)2016-0011。恒温室内饲养，温度25℃，湿度55%。

2 方法

2.1罗勒总黄酮的制备方法称取罗勒药材4 kg,用10倍量70%乙醇回流提取3 次，每次 2 h。过滤分离沉淀物，合并提取液，用氯仿萃取，真空干燥，得罗勒脂溶性组分。上AB-8大孔吸附树脂柱，分别用50%乙醇和95%乙醇洗脱，合并洗脱液，减压浓缩，冷冻干燥得罗勒总黄酮组分(含量>60%)。

2.2动物分组与给药方法将ApoE-/-小鼠50只随机分为5组，模型组(灌胃给予蒸馏水10 mL/kg体质量)、罗勒总黄酮低剂量组(灌胃给予罗勒总黄酮，60 mg/kg 体质量)、罗勒总黄酮中剂量组(灌胃给予罗勒总黄酮，120 mg/kg 体质量)、罗勒总黄酮高剂量组(灌胃给予罗勒总黄酮，240 mg/kg 体质量)和辛伐他汀组(灌胃给予辛伐他汀15 mg/kg体质量)，各组小鼠全程给予高脂饲料喂养。另取C57BL/6J小鼠10只作为空白组(灌胃给予蒸馏水10 mL/kg体质量)给予正常饲料喂养。

2.3指标的测定方法将饲养14 w的各组小鼠禁食12 h末次给药1 h后，用戊巴比妥麻醉眼眶静脉采血静置30 min析出血清，并取出小鼠主动脉组织。3 000 r/min离心 10 min收集血清，储存在-80℃超低温冰箱，待测。 用全自动生化仪检测各组小鼠血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)的水平。

2.4HE染色实验步骤取小鼠主动脉，固定、包埋、制成常规组织切片．HE染色后光镜下观察动脉组织的病理形态变化。

2.5血清白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-10(IL-10)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平检测取血清按ELISA试剂盒说明，酶标仪450 nm波长测定血清中IL-1，IL-6，IL-10，TNF-α含量。

2.6WesternBlotting法测定蛋白表达将主动脉组织在液氮中充分研磨，按1∶10加入裂解液，振荡,将裂解后样本12 000 r/min离心10 min，取上清液，保存在-80℃冰箱中; 蛋白定量(按BCA说明书)测定，根据蛋白分子量选择对应的PAGE凝胶浓度，先将电压调制80 V电泳，当样品到分离胶时，将电压调到120 V恒定，当溴酚蓝移动到离底部约0.5 cm时，停止电泳；转膜电流调到0.08 mA 转膜1 h, 封闭蛋白固定到PVDF膜上面，先后孵一抗二抗，用AP 法显色，用Bio-Red凝胶成像仪照相，再用Image J软件进行灰度分析。

3 结果

3.1各组小鼠血脂水平的比较与空白对照组相比，模型组血清TC、TG和LDL-C 水平升高，差异均有统计学意义(P <0.01)，HDL-C水平降低，差异均有统计学意义(P<0.01)；与模型组相比，辛伐他汀组血清TC、TG、LDL-C 水平降低，差异均有统计学意义(P<0.01)，HDL-C水平升高，差异有统计学意义(P<0.01)。与模型组相比，罗勒各剂量组的血清TG、TC、LDL-C 水平降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比，罗勒中高剂量组的血清HDL-C水平升高，差异有统计学意义(P<0.01),见表1。

表1 罗勒总黄酮对动脉粥样硬化ApoE-/-小鼠血脂水平的影响(mmol/L, ±s)

注：与空白组相比，★P<0.01； 与模型组相比,*P<0.05。

3.2各组小鼠主动脉组织切片HE染色结果在显微镜下通过HE染色观察各组小鼠主动脉组织切片，空白组小鼠主动脉血管壁均匀，内膜光滑，在主动脉内膜未观察到AS纤维斑块的形成。模型组小鼠主动脉根部内膜上观察到斑块的形成，而且血管壁纤维分裂成多层的间隙，内膜变厚并失去其原始波动，并且在显微镜下可见泡沫细胞浸润和纤维斑块。与AS模型组相比，罗勒总黄酮各剂量组小鼠主动脉血管壁弹力纤维排列密集，内膜略微增厚，偶尔观察到少量泡沫细胞和脂质斑块，病变程度轻于AS模型组，见图1。

3.3血清中炎症因子的水平测定结果与空白对照组相比，模型组IL-1、IL-6、TNF-α水平升高，差异有统计学意义(P<0.01)。与模型组相比，辛伐他汀组血清IL-1，IL-6，IL-10，TNF-α水平降低，差异有统计学意义(P<0.01)；罗勒各剂量组血清IL-1水平降低，差异有统计学意义(P<0.05);罗勒剂高量组的血清IL-6水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)；罗勒各剂量组小鼠血清TNF-α水平降低、IL-10水平升高，差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

A: 空白组

B: 模型组

C: 辛伐他汀组

D: 罗勒总黄酮低剂量组

E: 罗勒总黄酮中剂量组

F: 罗勒总黄酮高剂量组

图1 各组小鼠主动脉组织切片HE染色图 (HE×200)

注：与空白组相比，★★P<0.01； 与模型组相比,*P<0.05,**P<0.01。

3.4westernblot试验结果与空白对照组相比，模型组小鼠动脉NF-κB、IκB、ICAM-1、VCAM-1蛋白水平升高, 差异有统计学意义(P<0.01)。与模型组相比，辛伐他汀组小鼠主动脉NF-κB、IκB、ICAM-1、VCAM-1蛋白的表达有不同程度的降低, 差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)；罗勒总黄酮各剂量组小鼠主动脉NF-κB、IκB、ICAM-1、VCAM-1蛋白的表达有不同程度的降低, 差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)，见图2-5。

4 讨论

动脉粥样硬化是一种常见的以慢性炎症为主要特征的心血管系统疾病。临床和动物实验研究均显示高脂饮食会增加血浆炎性因子，他汀类药物具有降低血脂和抑制血清中黏附分子、 炎性因子的表达及激活磷酸化蛋白信号通路的作用，可用于防治动脉粥样硬化[11]。促炎细胞因子如肿瘤坏死因子α(TNF-α)由组织固有免疫细胞产生，诱导局部内皮细胞通过激活NF-κB通路，其调节内皮细胞中各种趋化因子和粘附分子的表达，如细胞间粘附分子-1(ICAM-1)和血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)[12]。氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)，TNF-α等细胞因子对内皮细胞、血管平滑肌细胞和单核巨噬细胞均有激活、促生长、趋化等促炎作用。急性冠状动脉综合症发作时，全身循环中白细胞被激活，外周血管IL-1，IL-6等炎症标志物水平增高，这说明炎症反应不仅局限于血管局部黏附分子、趋化因子等多种促炎因子和抗炎因子，其在斑块发展中起着关键的调节作用。NF-κB在VCAM-1的快速诱导中通过急性炎症和全身内皮活化的介质起着重要作用[13-14]。本研究采用高脂肪饮食诱导的ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化模型，发现罗勒总黄酮能降低血清TC、TG、LDL-C以及炎症因子IL-1、IL-6、TNF-α水平，使HDL-C和IL-10升高，但无统计学意义，还能减少主动脉窦斑块形成，作用与辛伐他汀相似。在动脉粥样硬化模型组观察到动脉的脂质蓄积和TNF-α的增高，NF-κB是一种普遍存在的转录因子，在细胞溶质中与抑制蛋白IκB结合是无活性的，IκB在ser32磷酸化后释放NF-κB并转位到细胞核。p65亚基是活化的NF-κB的关键组分，并调节多种炎症细胞因子IL-1、IL-6、TNF-α、ICAM-1、VCAM-1的表达[15-17]。VCAM-1和ICAM-1作为细胞粘附因子，并在炎症刺激期间增加表达，引发免疫应答，其介导淋巴细胞等与血管内皮细胞黏附，损伤血管内皮，引起血管功能障碍,并诱导动脉粥样硬化。本实验给药组VCAM-1和ICAM-1蛋白表达低于模型组，表明罗勒总黄酮可以通过抑制NF-κB的激活,降低小鼠动脉中具有损伤内皮细胞的VCAM-1和ICAM-1的表达，并抵抗动脉粥样硬化。综上所述，本研究证实罗勒总黄酮能够调节血脂代谢，减少炎症因子表达，抑制血管斑块形成，降低NF-κB信号通路的激活，从而预防和治疗动脉粥样硬化。

图2 各组NF-κB的表达情况及比较

(注： 与模型组相比,*P<0.05,**P<0.01)

图4 各组ICAM的表达情况及比较

(注： 与模型组相比,*P<0.05,**P<0.01)

图3 各组IκB及p-IκB的表达情况及比较

(注： 与模型组相比,*P<0.05,**P<0.01)

图5 各组VCAM的表达情况及比较

(注： 与模型组相比,*P<0.05,**P<0.01)