奥卡宁的提取分离及抗血小板聚集作用研究

王敬伟， 张永威， 李新霞， 李琳琳， 王 烨， 骆 新， 王丽凤， 毛新民,3

(新疆医科大学1药学院， 2基础医学院， 3中医学院， 乌鲁木齐 830011)

随着全球人口的老龄化、人们生活方式及习惯的改变，血栓性疾病已成为影响人类健康的重大问题[1]。昆仑雪菊(CoreopsistinctoriaNuff.)学名两色金鸡菊，为菊科(Compositae)金鸡菊属(Coreopsis)1年生草本植物[2]。两色金鸡菊头状花序中富含黄酮类成分，其中主要成分为查尔酮类和二氢黄酮类[3]。现代药理学研究表明两色金鸡菊具有抗糖尿病[4]、抗凝血[5]、降压[6]、降脂[7]等活性。本课题组前期研究发现两色金鸡菊提取物可以延长小鼠的凝血时间和出血时间[8]。有研究表明查尔酮化合物对由花生四烯酸和胶原蛋白引起的兔血小板的聚集有良好的抑制[9]。本研究采用硅胶柱层析法分离得到两色金鸡菊中的奥卡宁，采用红外、质谱、核磁进行结构鉴定，并对其抗血小板聚集作用进行探索，现报道如下。

1 仪器和试药

1.1仪器LC-20AB型高效液相色谱仪(日本岛津公司)，490-4D型血小板聚集仪(美国 Chrono-log公司)，BC-2300型准全自动三分群血液细胞分析仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)，中低压制备色谱(瑞士BUCHI公司)，CAMAG REPROSTAR3薄层色谱数码成像系统(瑞士卡玛公司)，硅胶G高效板(青岛海洋化工厂)，IR-Prestige红外光谱仪(日本岛津公司)，ACQUITY○RTQD质谱仪(美国 Waters公司)，Inova 600型核磁共振光谱分析仪(美国 Varian公司)。

1.2试药两色金鸡菊醇提物由新疆医科大学药理教研室自制(批号 20150526)，2-氨基乙基联苯基硼酸酯(美国 Sigma 公司，批号 D9754)，200～300目硅胶(青岛海洋化工厂，批号 3180216)，二磷酸腺苷(美国 Sigma公司，A2754)，凝血酶(美国 Sigma公司，批号 T6884)，阿司匹林(美国 Sigma公司，批号 A2093)。

2 方法与结果

2.1奥卡宁的制备两色金鸡菊干燥花序粉碎，乙醇回流提取，减压浓缩、干燥得到ETE。取适量ETE溶于的水，然后用正己烷和乙酸乙酯(1∶1)萃取，减压浓缩后制成浸膏，硅胶柱层析，干法上样。以二氯甲烷和甲醇(9∶1～5∶5)进行梯度洗脱，并收集洗脱液。通过TLC分析方法对各管洗脱液进行追踪分析，将相似组分合并后进行旋蒸得到奥卡宁结晶，经重结晶后得到纯度为97.4%的奥卡宁结晶。

2.2奥卡宁的纯度测定及结构鉴定

2.2.1 奥卡宁HPLC分析 称取适量奥卡宁，加甲醇溶解，制成样品溶液供测试用。HPLC分析条件：Shim-pack VP-ODS色谱柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)；流速1.0 mL/min；检测波长280 nm；柱温35℃；进样量10 μL；流动相A：0.5%甲酸水，流动相B：乙腈，以30%的乙腈进行等度洗脱，采用面积归一化法，测定奥卡宁的纯度为97.4%。

2.2.2 奥卡宁红外光谱分析 采用溴化钾压片法，于红外光谱仪扫描得红外吸收光谱。根据红外图谱可知3 388 cm-1与-OH的伸缩振动相符，表明结构中含有-OH；2 922 cm-1与C=C的伸缩振动相符，表明结构中含有C=C；1 637 cm-1与C=O的伸缩振动相符，表明结构中含有C=O；1 560～1 500 cm-1与苯环的伸缩振动相符，表明结构中含有苯环。本品的IR吸收光谱特征与奥卡宁结构相符，见图1、2。

图1 奥卡宁结构式

图2 奥卡宁红外吸收光谱图

2.2.3 奥卡宁质谱分析 称取奥卡宁，加甲醇溶解，制成样品溶液供测试用，分别测定供试品的一级和二级质谱图。质谱条件：电喷雾负离子化(ESI-)，毛细管电压2.5 kV，锥孔气压40 V，源温度120℃，脱溶温度350℃，氩气流速50 L/h，氮气流速750 L/h。结果表明，质谱扫描范围m/z 100～300，准分子离子峰[M-H]-m/z=287，提示分子量为288，与奥卡宁结构吻合；二级质谱的主要离子为287，151，135，按奥卡宁的结构对其碎片进行归属，能得到合理的解释，见图3。

图3 奥卡宁裂解示意图

2.2.4 核磁共振氢谱 取适量奥卡宁溶于氘代甲醇(CD3OD，99.9%)中供测试用，测定奥卡宁的1H-NMR。结果表明，1H NMR(600 MHz，CD3OD)在δ7.63(1H，d，J=15Hz，β-H)和δ7.45(1H，d，J=15.6Hz，α-H)处提示分子中含有不饱和的烯烃质子，δ7.44(1H，d，J=6.6Hz，H-6′)和δ6.38(1H，d，J=9Hz，H-5′)、δ7.09(1H，d，J=1.8Hz，H-2)、δ7.01(1H，d-d，J=1.8，8.4Hz，H-6)、δ6.73(1H，d，J=7.8Hz，H-5)分别为苯环上的氢。1H-NMR(CD3OD)谱表明，除去活泼氢共振峰外，分子结构中共有7种不同环境的7个质子的共振峰，与奥卡宁的分子结构中氢原子组成相符。由此，对奥卡宁中的氢的化学位移均进行了合理的归属。并且以上数据与文献[10]报道一致，故鉴定为奥卡宁。

2.3ETE、奥卡宁对血小板聚集的影响

2.3.1 血浆样品的制备 采集静脉血，血液以3.8%枸橼酸钠抗凝(9∶1)。血浆先以1 200 r/min离心10 min，吸取上层富血小板血浆(Platelet-rich plasma，PRP)，剩余血液3 000 r/min，离心15 min，吸取上清液为贫血小板血浆(Platelet-poor plasma，PPP)，用PPP调整PRP中的血小板个数为2×1011～3×1011个/L。

表1 ETE及奥卡宁体外对ADP诱导的血小板聚集的影响

注：与对照组比较：*P<0.05,**P<0.01。

2.3.3 ETE、奥卡宁体外对凝血酶诱导的血小板聚集的影响 取PRP随机分为空白组(生理盐水)、ETE高(900 μg/mL)、中(300 μg/mL)、低(100 μg/mL)剂量组、奥卡宁高(45 μg/mL)、中(15 μg/mL)、低(5 μg/mL)剂量组、ASA组(500 μg/mL)。用490-4D血小板凝聚仪测定各组血小板聚集率。按照Born比浊法，在比色杯中分别加入PPP和PRP，同时加入30 μL供试液，在37℃下孵育5 min，再加入20 μL凝血酶，测定血小板聚集率，记录5 min内最大聚集率。血小板抑制率=(对照组抑制率-药物组抑制率)/对照组抑制率×100%。与对照组相比， ETE中剂量组能抑制凝血酶诱导的血小板聚集，差异有统计学意义(P<0.05)，ETE高剂量组能抑制凝血酶诱导的血小板聚集，差异有统计学意义(P<0.01)；奥卡宁中剂量组能抑制凝血酶诱导的血小板聚集，差异有统计学意义(P<0.05)，奥卡宁高剂量组能抑制凝血酶诱导的血小板聚集，差异有统计学意义(P<0.01)，见表2。

表2 ETE及奥卡宁体外对凝血酶诱导的血小板聚集的影响

注：与对照组比较：*P<0.05,**P<0.01。

3 讨论

当血管破裂发生出血时，人体生理上会产生血管收缩、血小板聚集和血液凝固3个过程的生理性止血。多种凝血、抗凝和纤溶因子的质或量的变化，血管的结构或功能出现异常，以及血细胞，尤其是血小板的质或量异常，都会导致出血或血栓形成性疾病[11]。对于血栓形成的防治，可从降低血小板功能、保护血管内皮、促进纤溶活性、抑制血液凝固、降低血液黏滞性、改善血流动力与流态条件等方面采取措施[12]。本实验选择降低血小板功能这一途径进行研究。血小板活化途径主要有凝血酶、ADP、胶原、肾上腺素、血栓素A2、血小板活化因子等。其中ADP途径降低血小板中的cAMP的水平[13]，并能刺激血小板颗粒释放分泌TXA2[14]，激活纤维蛋白原受体，诱发血小板聚集。凝血酶是一种专一性很强的丝氨酸蛋白质水解酶，可以由无活性的凝血酶原转化而来。凝血酶可以直接作用于血液中的纤维蛋白原，催化其转变为纤维蛋白，促进血液凝块形成[15]。

综上所述，本研究对两色金鸡菊醇提物进行分离纯化得到一个单体查尔酮化合物，并通过红外、质谱、核磁鉴定其为奥卡宁。体外抗血小板聚集实验结果提示，两色金鸡菊醇提物和奥卡宁可以不同程度的抑制ADP和凝血酶引起的健康志愿者血小板聚集，并且表明两色金鸡菊醇提物抑制ADP诱导的血小板聚集时，奥卡宁为主要的活性物质，但奥卡宁抑制ADP诱导的血小板聚集的作用机制仍需进一步研究。