β-葡萄糖苷酶有效提升速溶乌龙茶粉水溶液的花香、果香及青草香

方可，李婷，朱艳冰,2,3，倪辉,2,3，黄高凌,2,3

（1.集美大学食品与生物学院，福建厦门 361021）（2.福建省食品微生物与酶工程重点实验室，福建厦门 361021）

（3.厦门市食品生物工程技术研究中心，福建厦门 361021）

香气是评价茶品质优劣的重要因素。茶叶中香气的实质是不同芳香成分以不同浓度组合的综合表现，研究茶叶产品香气特征及化学组成不仅可以丰富茶叶生物化学理论知识，而且对改善和提高茶叶香气品质也具有重要意义[1]。茶叶根据加工方式不同可分为白茶、黄茶、绿茶、乌龙茶、红茶和黑茶[2]，其中乌龙茶属于半发酵茶，既有绿茶的清香和花香，又有红茶的醇厚滋味，受到广大消费者喜爱[3]。随着人们生活节奏的加快，以及产业分工的精细化，速溶茶粉以其方便携带、容易加工等优点逐渐成为茶叶食品的重要中间体[4]，但是由于速溶茶粉在加工过程中经过高温浸提、真空浓缩、喷雾干燥等加工工艺，导致茶叶原有风味成分大量损失，如朱旗等人[5]研究发现，喷雾干燥后的速溶茶粉香气与茶叶香气相差较大。茶中香气成分主要来源于类胡萝卜素降解、油脂氧化、糖苷类前体水解和美拉德反应[6]。相关研究表明，许多香气成分以糖苷类前体的形式存在于茶叶中[7]，并且茶本身存在一些可以水解前体成分释放香气成分的关键酶类，例如β-葡萄糖苷酶、β-半乳糖苷酶和β-樱草糖苷酶等[8]。在茶叶及速溶茶粉加工过程中，虽然高温会导致内源糖苷酶失活，但是残留的糖苷类前体仍然可以在外源糖苷酶作用下释放出香气成分。

改善速溶茶粉香气的众多方法中，酶技术是较为有效的方法[9]，因为酶可特异性地作用于香气前体释放出游离的香气成分[10]，且不影响其他活性及风味成分，因此可在速溶茶粉后续加工产品生产的配料过程中进行酶反应而改良风味。有学者利用外源β-葡萄糖苷酶处理绿茶汤后，顺式-3-己烯醇、水杨酸甲酯和芳香族醇含量显著增加[11]。β-葡萄糖苷酶处理绿茶、乌龙茶和红茶后香气精油总量分别增加了 20.69%、10.30%和6.79%[12]。虽然已有研究报道β-葡萄糖苷酶对茶汤和茶饮料的影响，但由于不同茶叶产品中残留的香气前体不同，目前尚不明确各类速溶茶粉中香气前体的种类及含量，且尚未研究β-葡萄糖苷酶对速溶茶粉产品香气的释放作用。

针对以上研究现状，本文用β-葡萄糖苷酶对速溶乌龙茶粉水溶液进行处理，综合运用GC-MS、感官品评和OAVs分析评价酶处理前后的香气变化，阐明β-葡萄糖苷酶对速溶乌龙茶粉水溶液香气的改良效果，为提高速溶茶粉后续加工产品的风味提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

喷干型速溶乌龙茶粉，由福建大闽食品有限公司提供。

1.2 主要试剂

β-葡萄糖苷酶购于上海源叶公司；环己酮、正构烷烃（C8-20）、2-甲基呋喃、2-乙基呋喃、N-乙基吡啶、芳樟醇、壬醛、癸醛、反式-β-罗勒烯、α-萜品烯、萜品油烯、γ-萜品烯、壬醛、3,5-二甲基苯酚、2-戊基呋喃购于美国 Sigma公司；香叶醇、苯甲醛、顺式-3-己烯醇、水杨酸甲酯、己酸己酯、伞花烃、柠檬烯、反式-β-罗勒烯、己醇、辛醇购于英国Alfa Aesar公司。

1.3 主要仪器

手动 SPME进样器，美国 Supelco公司（Bellefonte，PA，USA）；50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头购于美国Supelco公司；QP 2010气相色谱-质谱联用仪（GC-MS），日本岛津公司；Rtx-5MS色谱柱购于美国 Restek公司（Bellefonte，PA，USA）；RO-03A制冰机购于深圳市日欧制冷设备有限公司；GZX-DH电热恒温干燥箱购于上海跃进医疗器械厂。

1.4 实验方法

1.4.1 样品的制备

速溶乌龙茶粉水溶液样品：称取3 g速溶乌龙茶粉于60 mL顶空瓶中，加入30 mL纯水。

β-葡萄糖苷酶溶液：在60 mL顶空瓶中加入β-葡萄糖苷酶（10 U）和30 mL纯水。

β-葡萄糖苷酶处理速溶乌龙茶粉水溶液样品：称取3 g速溶乌龙茶粉于60 mL顶空瓶中，加入30 mL纯水和β-葡萄糖苷酶（10 U）。

1.4.2 GC-MS分析的操作条件[13]

样品在40 ℃水浴锅中平衡1 h后吸附20 min，在进样口处解吸附3 min。按照以下的条件进行GC-MS分析。

色谱条件：色谱柱是 Rtx-5MS（60 m×0.32 mm×0.25 μm），用高纯氦气（纯度99.999%）作为载气，柱流量为3 mL/min，不分流进样。升温程序：选择程序升温，进样口温度为230 ℃；最初温度为50 ℃并保持5 min，以3 ℃/min升温至200 ℃，在200 ℃保持1 min。

质谱条件：离子源温度为 200 ℃，电离方式为EI，电离能量为70 eV，接口温度为250 ℃，扫描方式选择SCAN模式进行定性分析，离子碎片的扫描范围为35～500 m/z。溶剂延迟时间为1.5 min。定量分析时质谱扫描方式设为SIM模式。

1.4.3 挥发性成分的定性、定量分析

样品通过GC-MS进行分析，将特征离子峰和保留指数与标准品、挥发性成分谱库（NIST08、NIST08s、FFNSC1.3）以及参考文献进行对照后定性。其中，保留指数运算借鉴 Kratz和 Vandendoo[14]的方法：RIx=100n+100[t(i)-t(n)]/[t(n+1)-t(n)]进行计算，其中RIx为待测定成分的保留指数，t(i)为待测成分的调整保留时间，t(n)表示具有n个碳原子数的正构烷烃的调整保留时间，t(n+1)表示具有 n+1个碳原子数的正构烷烃的调整保留时间，平行试验一组三次。对于2-甲基呋喃和顺式-3-己烯醇等21种成分通过标准曲线定量，其余16种成分通过内标环己酮进行定量（SIM模式，内标法，内标物环己酮，特征碎片为55）。

1.4.4 挥发性成分的感官评价

根据 ISO 8589标准和相关文献[13,15]方法为参考对速溶乌龙茶粉及β-葡萄糖苷酶处理的速溶乌龙茶粉进行感官评价分析，选取青草香、花香、甜香、果香和焦糖香为作为感官评价的指标。

1.4.5 挥发性成分香气强度值的计算

香气强度值（OAVs）的计算公式：香气强度值（OAVs）=嗅感成分浓度/阈值。

1.4.6 统计分析

显著性分析和主成分分析通过 Excel 2013和SPSS 19.0软件进行分析完成。

2 结果与讨论

2.1 β-葡萄糖苷酶处理速溶乌龙粉的挥发性成分定性分析

对速溶乌龙粉及其经β-葡萄糖苷酶处理后的挥发性成分进行GC-MS分析，得到挥发性成分的总离子流图（如图1），然后依据相似度检索、特征离子碎片分析和标准品对比以及参照相关文献，共鉴定出37种挥发性成分（如表1），其中呋喃类4种，醛类5种，醇类9种，酯类4种，烯烃类11种和其它类4种。醇类和烯烃类占总挥发性成分的54%，为主要组成部分，醛类次之。由此可知，醇类、萜烯类、醛类为主要挥发性成分。

图1 速溶乌龙茶粉水溶液、酶处理样品及β-葡萄糖苷酶溶液挥发性物质的总离子流图Fig.1 Total ion chromatogram (TIC) of the volatiles in instant oolong tea infusion (A), the enzyme treated sample (B) and β-glucosidase solution (C)

表1 速溶乌龙茶粉水溶液及β-葡萄糖苷酶处理后样品中挥发性成分的鉴定及标准曲线Table1 Identification and standard curves of volatile compounds in instant oolong tea iufusion and the β-glucosidase treated sample

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注：保留指数为Rtx-5MS色谱柱结果，RIxa是本研究测定值，RIxb为文献报道的数值，SCIS为内部标准曲线来估计的浓度变化，Std为标准品对照作为鉴定依据，MS为质谱库（NISTO8，NISTO8s，FFNSC 1.3）搜索结果作为鉴定依据，TI代表成分暂时依靠数据库检索鉴定，P表示参考文献，P[n]表示第n篇参考文献，未标明的P均参考此网站：http://www.flavornet.org/flavornet.html,nd为未检测到的成分。

2.2 β-葡萄糖苷酶处理速溶乌龙粉的挥发性成分定量分析

按1.4.3所述方法，根据各成分峰面积（图1）及标准曲线（表1）进行定量分析，结果如表2所示。

从表2可知，速溶乌龙茶粉水溶液中鉴定出了26种挥发性成分，包括醛类4种、醇类1种、烯烃类11种、酯类2种、呋喃类4种及其他类化合物4种；β-葡萄糖苷酶处理速溶乌龙茶粉水溶液中鉴定出了 35种挥发性成分，包括醛类5种、醇类9种、烯烃类9种、酯类4种、呋喃类4种及其他类化合物4种。结果表明速溶茶粉挥发性成分以烯烃类为主，而酶处理后以醇类、烯烃类和醛类为主，该结果与周玲[3]所研究的乌龙茶挥发性成分以萜烯类、酯类和醇类为主相似。速溶茶粉主要挥发性成分为癸醛、反-β-罗勒烯、α-法呢烯、2-甲基呋喃和2-乙基呋喃，与之前学者[19,20]报道的乌龙茶主要挥发性成分橙花叔醇、茉莉酮酸甲酯、茉莉内酯、吲哚和法呢烯对比相差较大，其原因可能是速溶茶粉加工过程中发生氧化、缩合、聚合和基团转移等造成速溶茶粉挥发性成分和原茶叶挥发性成分的差异[9,21]；与靳巧丽等人[22]所报道的速溶乌龙茶粉主要挥发性成分芳樟醇、反式-β-罗勒烯、反式芳樟醇氧化物、顺式芳樟醇氧化物以及 Zhang等人[13]所报道的速溶乌龙茶粉主要挥发性成分 3，5-二甲基苯酚、3，7-二甲基-1，5，7-辛三烯-3-醇、2-甲基呋喃、辛醛对比也不一致，其原因可能是不同的速溶茶粉生产工艺会导致挥发性成分的差异。

β-葡萄糖苷酶处理后速溶乌龙茶粉主要挥发性成分为顺式-3-己烯醇、香叶醇、苯甲醛、癸醛、反式-β-罗勒烯、2-甲基呋喃、2-乙基呋喃和2，4-二叔丁基苯酚。酶处理后增加的挥发性成分有醇类、醛类和酯类，醇类总含量从33.07 μg/L增加到22807.5.9 μg/L，其中顺式-3-己烯醇（0 vs 15416.97 μg/L）和香叶醇（0 vs 6542.42 μg/L）；醛类含量增加了 6381.47 μg/L，其中苯甲醛（0 vs 707.32 μg/L）和癸醛（41824.02 vs 47555.64 μg/L)；酯类含量增加了 405.47 μg/L，其中水杨酸甲酯（0 vs 268.81 μg/L），该结果表明β-葡萄糖苷酶作用于速溶乌龙茶粉后挥发性成分发生变化主要和糖苷类前体有关，目前从茶叶中分离出20多种糖苷，大多数为二糖苷和单糖苷，其中单糖苷以β-葡萄糖糖苷为主[23]。醇类成分中顺式-3-己烯醇的前体为β-葡萄糖糖苷和β-樱草糖苷；香叶醇的前体为β-葡萄糖糖苷、β-樱草糖苷和香叶基-β-巢菜糖苷[6]，因此，在β-葡萄糖苷酶的作用下可以生成顺式-3-己烯醇和香叶醇，这与文献[24]的报道一致；醛类成分的变化与文献[25,26,27]的报道相一致，有学者利用黑曲霉胞外酶处理速溶绿茶粉后苯甲醛增加，并且已有研究表明黑曲霉胞外酶中含有β-葡萄糖苷酶，据相关文献报道苯甲醛前体为野黑樱苷，糖基部分为β-葡萄糖苷，所以在β-葡萄糖苷酶作用下可释放出苯甲醛；酯类成分的变化与文献[12,28]一致，其前体为β-樱草糖苷，经β-葡萄糖苷酶处理后水杨酸甲酯、香叶醇和顺式-3-己烯醇含量显著增加。此外，醇类成分中还增加了己醇、2-庚醇、2-甲基己醇、辛醇和壬醇，其中己醇从0增加到了476.1 μg/L，这与文献[29]的研究一致，经β-葡萄糖苷酶处理后，风味前体成分可以释放己醇、正丁醇和顺式-3-己烯醇。综合比较上述几类香气成分的变化，在β-葡萄糖苷酶的作用下，速溶乌龙茶粉的挥发性成分及含量具有显著性增加。

表2 速溶乌龙茶粉水溶液以及β-葡萄糖苷酶处理后样品挥发性成分定量表Table 2 Quantitative determination of volatile components of instant oolong tea infusion and the β-glucosidase treated sample

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注：OIOT表示速溶乌龙茶粉水溶液，EIOT表示β-葡萄糖苷酶处理速溶乌龙茶粉水溶液，nd为没有检测到的挥发性成分，每一行中，不同的字母（a，b）代表数值间存在着显著性差异（p＜0.05）。

2.3 感官评价

茶的挥发性成分之间以及挥发性成分与非挥发性成分之间都存在复杂的相互作用，仅通过香气成分的含量以及香气成分的贡献率对茶的香气作出评价是不够的。为此，依照1.4.4的方法对样品进行感官分析，结果如表 3。速溶乌龙茶粉水溶液以甜香和焦糖香为主，经过β-葡萄糖苷酶处理后，青草香、花香、果香

显著增强，而焦糖香大幅度降低，整体香味以青草香、花香、果香为主，此结果与文献[13]的报道相似。其原因可能是β-葡萄糖苷酶与茶粉中糖苷类前体发生反应，促进了花香、青草香和果香挥发性成分的释放，例如顺式-3-己烯醇、苯甲醛、水杨酸甲酯等，从而使速溶乌龙茶在加工过程中产生的不良风味得到改善，焦糖香显著减少，也可能是因为青草香、花香和果香的增加掩盖了焦糖香，使得整体香气更加柔和。

表3 速溶乌龙茶粉水溶液以及β-葡萄糖苷酶处理后样品感官评价表Table 3 Sensory evaluation of instant oolong tea infusion and the β-glucosidase treated sample

为进一步分析酶处理后速溶乌龙茶粉水溶液整体香气的变化，对花香、青草香、甜香、果香和焦糖香进行主成分分析，其结果如图2所示。

图2 感官评价的主成分及得分散点图Fig.2 Principal components and scatter plot of sensory evaluation scores

由图2a可知，主成分1（PC 1）可以解释总变量的68.5%，与甜香、花香、青草香和果香的感官评价数值呈现正相关，与焦糖香数值呈现负相关。主成分2（PC 2）可解释总变量的17.5%，与甜香和花香和焦糖香的感官评价数值呈现正相关，与果香和青草香数值呈现负相关。从速溶乌龙茶粉水溶液和酶处理后的样品主成分分析散点图来看（图 2b），两者之间存在显著差异，此结果进一步表明，β-葡萄糖苷酶处理后速溶乌龙茶粉水溶液的香气得到显著改善，可将其应用于茶饮料等产品生产的前处理环节中，提高相关产品的风味。

2.4 香气强度值（OAVs）分析

为更直观反映速溶茶粉的香气结构，参考相关文献已报道的阈值并结合GC-MS检测结果计算各挥发性成分的 OAVs，如表4所示。β-葡萄糖苷酶处理后香气强度总值为2107.8，比处理前增加了约14%，其中贡献较大的成分有顺式-3-己烯醇（220.2）、香叶醇（163.6）、3-甲基丁醛（366.0）、2-乙基呋喃（311.1）和癸醛（792.6），占总香气强度的88%。其中顺式-3-己烯醇和香叶醇有较低的阈值、较高的香气强度值，赋予速溶乌龙茶粉青草香和玫瑰香，这就进一步解释了感官评价中经β-葡萄糖苷酶处理后的速溶乌龙茶粉具有更强的青草香和花香。这一结果与文献[13,15]的报道基本相一致，只是不同的速溶茶粉香气有一定的差异，这主要是由于加工方式不同导致的差异。

表4 速溶乌龙茶粉水溶液以及β-葡萄苷酶处理后样品香气强度值Table 4 Odor activity values of instant oolong tea infusion and β-glucosidase treated sample

3 结论

通过GC-MS分析表明β-葡萄糖苷酶处理前后速溶乌龙茶粉水溶液共鉴定出37种挥发性成分，其中速溶乌龙茶粉水溶液中鉴定出26种，β-葡萄糖苷酶处理的样品中鉴定出35种。经过β-葡萄糖苷酶处理后，顺式-3-己烯醇、己醇、香叶醇、苯甲醛和水杨酸甲酯等成分的含量显著增加；青草香、花香、果香显著增强，而焦糖香大幅度降低；顺式-3-己烯醇和香叶醇的香气强度值大幅度增加。该研究结果表明，β-葡萄糖苷酶可用于处理速溶茶粉水溶液，从而提高茶叶饮料、茶糕点等产品的风味。