肝郁脾虚证胃溃疡大鼠的尿液代谢组学研究*

余王琴 郑小伟 杜仲燕

浙江中医药大学 浙江 杭州 310053

胃溃疡（GU）是消化系统最常见的疾病之一，因起病隐匿及不积极治疗等因素，常引起出血、穿孔及癌变等严重后果[1]。胃溃疡属中医学“胃脘痛”范畴，肝郁脾虚为其主要病机。代谢组学作为系统生物学的研究方法之一，且其整体研究思路与中医药的整体论与系统观不谋而合，这有助于揭示中医药复杂作用机制[2-3]。本次研究运用基于高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱联用（HPLC-Q-TOF/MS）技术的代谢组学方法分析胃溃疡肝郁脾虚证的可能生物学机制。

1 材料

1.1 动物：清洁级SD雄性大鼠32只，体重160±20g，由浙江中医药大学实验动物中心提供，常规、恒温饲养。

1.2 主要试剂与仪器：甲酸(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)，乙腈(色谱级，美国Tedia公司)，1260 infinity高效液相色谱仪，Eclipse Plus C18色谱柱(2.1×50.0mm，1.8µm)，Agilent 6520 Q-TOF/MS质谱系统（美国安捷伦公司）；Centrifuge 5417R高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)；Milli-Q Biocel纯水仪（美国Millipore公司）；SIMCA-P(瑞典Umetrics公司)。

2 方法

2.1 动物分组：大鼠适应性饲养7天后，按照随机数据表将32只大鼠分为正常对照组、胃溃疡肝郁脾虚证模型组各16只。

2.2 造模：采用多因素复合模拟中医病因结合乙酸烧灼法[4]复制胃溃疡肝郁脾虚证模型，随机取正常组与胃溃疡肝郁脾虚证模型组大鼠各8只模型验证。

2.3 样品采集与处理：模型验证成功后，采用代谢笼收集两组大鼠24h尿液，保存于-80℃冰箱备用。室温下解冻尿液样品，取200μl尿样置于离心管中，加入600μl双蒸水，涡旋，低温高速离心。取上清液过0.22μm尼龙微孔滤膜，进样液相质谱分析。质量控制：从4组实验样本中抽取等量的尿液混合，制得质量控制样品，处理同样品处理。在采集数据之前，使用质控品进样，每采集8个实验数据，进行1次质量控制品的分析。

2.4 色谱与质谱条件优化：色谱柱为Eclipse Plus C18(2.1×50mm，1.8μm)，流动相A为0.1%甲酸水溶液，B为0.1%乙腈。样品采用梯度洗脱，在22min内从起始5%B增加至95%B，后运行时间设定为3min；流速设定为0.1mL·min-1；进样量为4μL。质谱主要参数为：质荷比的采集范围为50～1000m/z，干燥气N2流速为10L/min，雾化气压力为3.1bar，毛细管电压设定为4000V，溶剂化离子去簇电压为150V，锥孔电压为60V。质谱数据采集使用Centroid模式保存质谱数据，数据采集速率为2spectrum/s。

2.5 数据处理：采用Mass Hunter软件处理获得的尿样图谱代谢物信息，利用Mass Profiler Professional（MPP）软件进行数据预处理，再行主成分分析(PCA)与偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)。得到得分图和载荷图。利用SIMCA-P验证MPP分析结果，再根据精确的分子质量数在METLIN、KEGG、Massbank和HMDB数据库中进行检索比较，鉴定潜在标记物，分析代谢通路。

3 结果

3.1 一般情况观察：正常组大鼠精神良好，动作灵活自如，毛发光洁，摄食正常，体肌强健。造模大鼠易激惹，摄食减少，便质稀软、味重，毛发疏散不洁或竖起，成群蜷卧。

3.2 两组尿液样品的LC-MS分析及总离子流图（TIC）：利用ESI离子模式分别采集尿液样本数据，得到两组尿液代谢物典型的总离子流图（图1）。

图1 典型的总离子流图

3.3 正常组与模型组模式识别结果：见图2。由图可知，胃溃疡肝郁脾虚证模型组和对照组明显的分离，说明两组大鼠尿液中代谢物种类或者数量上存在一定差异。

图2 PCA、PLS-DA得分图与PLS-DA载荷图

3.4 差异代谢物的鉴定：根据差异代谢物的精确分子量和二级质谱图，鉴定差异代谢物。通过统计学分析和质谱图验证，使用精确分子量数据检索，再通过负离子模式下的二级质谱碎裂方式推测代谢物结构，最后通过METLIN数据库MS/MS谱图对比的方法鉴别，9种代谢标记物得到鉴定，鉴别结果如表1所示。

表1 差异代谢物鉴别结果

4 讨论

苯甲酸（Toluate）在肝脏和甘氨酸结合成马尿酸。有研究[5]显示马尿酸可正确反映肝脏的能量代谢情况。甘氨酸为中枢神经系统的抑制性神经递质，武雯等[6]研究发现甘氨酸具有减轻炎症反应、降低内毒素作用，可通过拮抗内毒素起到保护胃肠免疫屏障的作用。精氨酸是体内合成一氧化氮(NO)的前体，NO主要通过影响壁细胞、粘液细胞、主细胞及其它胃肠上皮细胞的功能，来调控黏膜损害因子或保护因子的分泌如胃蛋白酶、胃酸、粘液等。Amino-5-oxohexanoate是赖氨酸的代谢产物，过高浓度的赖氨酸能引起高胃蛋白酶水平，不利于胃黏膜修复。4-羟基谷氨酸（4-hydroxy-glutamate）与谷氨酸可转化，谷氨酸是脑内重要的神经递质[7]。Glu系统可能参与情感障碍发病过程，抑制谷氨酸受体相关信号转导或降低谷氨酸活性的药物具抗躁狂功效[8]。2-Hydroxy-3-(4-hydroxyphenyl)propenoic acid参与了酪氨酸的代谢。肾上腺素、去甲肾上腺素和多巴胺等物质是酪氨酸转换而来的，发挥调节胃肠功能的作用。(3R)-3-isopropenyl-6-oxoheptanoic acid为庚酸，Tumonoic Acid F为酮酸。2,6dimethylheptanoyl carnitine为酰基肉碱。酰基肉碱是L-肉碱生成的，L-肉碱在哺乳动物的能量和脂肪代谢中发挥关键作用。

综上，研究发现胃溃疡肝郁脾虚证模型大鼠发病过程中伴随着能量代谢、脂肪酸、氨基酸物质代谢障碍与神经调节紊乱。