健脾疏肝解毒方抗酒精性肝病肝损伤作用研究*

孟爱红 陈芝芸 莫耘松 付克模 何蓓辉 程时峰

1 浙江省杭州市余杭区中医院 浙江 杭州 311106

2 浙江省中医院 浙江 杭州 310006

酒精性肝病（ALD）是因长期过量饮酒引起的中毒性肝脏疾病。健脾疏肝解毒方是我们临床上治疗ALD的有效中药复方[1]。本研究建立酒精性肝病小鼠模型，以健脾疏肝解毒方进行干预，观察其对生化、病理以及氧化应激的影响，为临床进一步应用提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物：SPF级健康雄性C57BL/6J小鼠50只，6～8周龄，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK（沪）2012-0005。

1.2 主要药物与试剂：Lieber-DeCarli液体饲料由南通特洛菲饲料科技有限公司提供；健脾疏肝解毒方由生黄芪、白术、泽泻、茵陈、柴胡、川楝子、片姜黄、丹参、枳椇子、葛根、半夏组成，按5∶2∶2∶2.5∶1∶1.5∶1.5∶2.5∶2.5∶1.5∶1.5比例由浙江省中医院中药制剂室制成流浸膏。丙氨酸氨基转移酶（ALT）试剂盒、天门冬酸氨基转移酶（AST）试剂盒、胆固醇（TC）试剂盒、甘油三酯（TG）试剂盒均由上海申能—德赛诊断技术有限公司提供；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）、考马斯亮兰蛋白测定试剂盒为南京建成生物工程研究所产品。

1.3 实验方法：小鼠随机分为正常组、模型组、中药高剂量组、中药中剂量组、中药低剂量组共5组，每组10只。各组小鼠环境适应3天（给予颗粒饲料），液体饲料适应4天（给予不含乙醇的常规液体饲料）后，正常组给予不含乙醇的常规液体饲料喂养，其它各组以低浓度乙醇（5%）的Lieber-DeCarli液体饲料喂养13天，在造模的同时中药高、中、低剂量组分别灌服42.86g/kg/d、21.43g/kg/d、10.72g/kg/d的健脾疏肝解毒方流浸膏，正常组和模型组则灌服等容量的生理盐水，连续13天。第14天早上7点～9点以高浓度乙醇（30%）液体饲料灌胃，监测小鼠情况，9小时后，用异氟烷麻醉小鼠，眼眶取血，分离血全自动生化仪检测血清AST、ALT、TG、TC水平；断颈处死小鼠后分离肝脏，部分进行肝组织匀浆，采用考马斯亮兰法检测肝组织匀浆蛋白含量，MDA采用硫代巴比妥酸检测，GSH-PX活力采用分光光度法检测；部分于10%中性甲醛固定，常规石蜡包埋，HE染色，参考中华医学会肝病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组2010年制订的《酒精性肝病诊疗指南》光镜观察肝组织脂肪变和炎症程度等病理学变化。

1.4 统计学方法：采用SPSS25.0软件进行统计分析，数据采用mean±SD表示，采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 健脾疏肝解毒方对酒精性肝病小鼠生化的影响：模型组血清AST、ALT、TG水平较正常组明显增高（P＜0.01），TC水平较正常组明显降低（P＜0.01）；中药各剂量组血清AST水平及中药高剂量组血清ALT水平均较模型组明显降低（P＜0.05，P＜0.01），中药中、低剂量组ALT水平与模型组差异无显著性（P＞0.05）；各治疗组TG及TC水平与模型组无明显差异（P＞0.05）。见表1。

2.2 健脾疏肝解毒方对酒精性肝病小鼠肝组织的影响：光镜下正常组小鼠肝组织结构正常，模型组小鼠可见大量脂肪滴沉着，有炎细胞浸润，部分中见小叶内坏死灶。各治疗组组织病理与模型组相似，但脂滴沉积程度有所减轻。见图1。

2.3 健脾疏肝解毒方对酒精性肝病小鼠肝脏MDA含量、GSH-PX活力的影响：模型组小鼠肝组织匀浆MDA含量较正常组明显增多（P＜0.01），GSH-PX活力较正常组显著降低（P＜0.01）；中药各剂量组小鼠肝脏MDA含量较模型组明显下降（P＜0.05，P＜0.01）；中药高、中剂量组小鼠肝组织GSH-PX较模型组明显增高（P＜0.05），中药低剂量组与模型组无统计学差异（P＞0.05）。见表2。

表1 健脾疏肝解毒方对酒精性肝病小鼠生化的影响（±s）

表1 健脾疏肝解毒方对酒精性肝病小鼠生化的影响（±s）

注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

TG（mmol/L）0.57±0.05 1.11±0.24**1.08±0.28**1.14±0.25**1.00±0.10**分组正常组模型组中药高剂量组中药中剂量组中药低剂量组ALT（IU/L）31.11±3.52 71.89±17.22**49.81±8.99**#58.86±15.93**56.51±10.07**AST（IU/L）172.16±46.71 227.76±90.07**160.86±17.43##176.11±19.62#169.65±14.77#TC（mmol/L）4.39±0.44 3.37±0.39**3.44±0.33**3.23±0.32**3.38±0.21**

图1 各组小鼠病理变化情况（HE×200）

表2 健脾疏肝解毒方对酒精性肝病小鼠肝脏MDA、GSH-PX的影响（±s）

表2 健脾疏肝解毒方对酒精性肝病小鼠肝脏MDA、GSH-PX的影响（±s）

注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

GSH-PX（酶活力单位/mgprot）160.42±32.33 119.29±17.97**143.91±29.91#146.46±16.29#135.49±29.02*分组正常组模型组中药高剂量组中药中剂量组中药低剂量组MDA（nmol/mgprot）170.11±0.58 4.93±0.95**3.10±0.51**##3.64±0.84**##4.22±0.65**#

3 讨论

根据ALD的病因、病理及临床特征，中医学将其归属为“伤酒”“胁痛”“酒疸”“水臌”“酒癖”“酒积”等范畴。酒味苦，性辛热，且能助湿，少量饮酒有益，过量则为害。酒的过量摄入，使湿、热、毒蕴结体内，损伤肝脾，致肝之疏泄和脾之运化功能失职，肝郁脾虚，气血不和，痰浊内生，气、血、痰、湿相互搏结，停于胁下，形成积块（酒癖）。其病机可归纳为：脾胃气虚、痰湿内阻、水湿内停、气血不和、气滞血瘀等，其中，酒伤肝脾、聚湿生痰为发病关键，素体禀赋不足、脾胃虚弱为发病之本[2]。我们在临床上以健脾祛湿、疏肝理气、化瘀解毒为治疗法则，并制成健脾疏肝解毒方。方中重用生黄芪、白术益气健脾，茵陈、泽泻清热利湿，柴胡、川楝子疏肝理气，半夏燥湿化痰散结，丹参、葛根、枳椇子、片姜黄活血化瘀解毒，肝脾同治，共奏健脾疏肝解毒之功，临床收到良好疗效。

本实验参考Ki SH等[3]建立的酒精性肝病模型，采用低浓度乙醇液体饲料喂养小鼠13天后，再加1次高浓度的乙醇灌胃，模仿了人类临床上的慢性酒精依赖患者1次醉酒后的酒精性肝炎的急性发作情况，较单纯灌服Lieber-DeCarli液体饲料或酒精等更接近人类的酒精性肝炎的特点。实验显示，模型组小鼠肝组织有大量脂质沉积，血清TG、ALT、AST明显增高，提示酒精性肝病模型成功。模型组小鼠TC水平较正常组明显降低可能与小鼠进食酒精饲料，食欲下降导致的隐性营养不良有关。目前认为，机体摄入酒精后可通过多种代谢途径产生大量活性氧基团（ROS）[4]，ROS可攻击生物膜上的脂质诱发脂质过氧化，进一步形成MDA等脂质过氧化产物。GSH-PX是清除ROS的一种主要酶，可通过清除H2O2起到抗氧化损伤的作用而保护肝组织。本实验发现，酒精性肝病模型小鼠肝组织MDA含量升高，GSH-PX活力下降。经健脾疏肝解毒方干预后，小鼠ALT、AST水平有不同程度降低，肝组织脂肪沉积减少，同时GSH-PX活力提高，MDA水平降低，提示具有健脾祛湿、疏肝理气、化瘀解毒作用的健脾疏肝解毒方能通过增强机体的抗氧化能力，减少脂质过氧化而减轻酒精引起的肝组织损伤。