淫羊藿-仙茅药对有效成分在骨髓炎兔体内的药动学研究*

王娜妮 许平翠 张 扬 寿 旦

浙江省中医药研究院 浙江 杭州 310007

骨髓炎具有病程长、反复发作、易致残等特点，是骨科复杂病种。淫羊藿-仙茅是常用治疗骨病的温补肾阳药对，能促进成骨细胞生长，修复骨缺损。本研究采用骨髓炎兔模型，研究淫羊藿和仙茅配伍前后有效成分的体内药动学行为变化，探讨药对配伍协同增效的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物：雄性新西兰兔，3月龄，体质量为2.2±0.1kg，浙江省实验动物中心提供。动物质量合格证号：SYXK（浙）2017-0009。

1.2 药品：淫羊藿、仙茅饮片购自华东医药公司，经浙江省中医药研究院俞忠明副主任中药师鉴定为小檗科植物淫羊藿Epimedium brevicomu Maxim.的干燥叶和石蒜科植物仙茅Curculigo orchioides Gaertn.的干燥根茎。对照品淫羊藿苷（纯度≥98%，批号：489-32-7）、朝藿定A（纯度≥98%，批号：MUST-12062311）、朝藿定B（纯度≥98%，批号：MUST-12062312）、朝藿定C（纯度≥98%，批号：MUST-12062313）、仙茅苷（纯度≥98%，批号：85643-19-2）、苔黑酚葡萄糖苷（纯度≥98%，批号：15072213）均购自北京世纪奥科生物技术有限公司。

1.3 试剂与仪器：甲醇、乙腈均为色谱纯（德国Merk公司）；生理盐水（批号：A16032301）购自浙江科伦制药有限公司。其他试剂均为分析纯。Xevo TQD超高效液相色谱-三重四级杆质谱仪（美国Waters）；Smart2Pure UV/UF超纯水仪（美国Thermal fisher）；AE240电子天平（瑞士Mettler）；Microfuge 20R离心机（美国Beckman coulter）；Lab dancer S25涡旋振荡混合器（德国Ika）。

1.4 药对及单味药材提取物的制备：取淫羊藿、仙茅各10g，混合，加药材重量20倍量的水，煎煮1h，滤过，药渣加20倍量的水，煎煮1h，滤过，合并2次煎煮液，浓缩至生药含量为淫羊藿和仙茅各1.5g/ml的水提液。取淫羊藿、仙茅药材各10g，分别单煎，加水量、煎煮次数及方法同药对水提液制备方法，制备生药含量均为1.5g/ml的淫羊藿水提液及仙茅水提液。

1.5 骨髓炎兔模型制备及分组：参照课题组前期已建立的造模方法[1]，进行造模手术，术后4周验证模型。造模成功的骨髓炎兔随机分为：模型组、淫羊藿组、仙茅组、药对组，每组3只。

1.6 给药及血浆制备：除模型组外，其余各组采用清创手术-局部抗炎-灌胃给药治疗方案：按50mg/只的万古霉素给药剂量，病灶局部置入载万古霉素硫酸钙。淫羊藿组给予6g/kg/d淫羊藿提取液，仙茅组给予6g/kg/d仙茅提取液，药对组给予6g/kg/d淫羊藿+6g/kg/d仙茅的药对提取液。另取正常动物设空白对照组。给药前12h禁食，自由饮水，给药后8h统一禁食。连续灌胃给药5d。第5d灌胃后，分别在后0.1、0.3、0.5、0.7、1.0、2.0、3.0、4.0、8.0、10.0、20.0、30.0h，兔耳缘静脉取血0.3ml，将血液置入装有肝素钠抗凝的离心管中，4℃下5000rpm迅速离心10min，取上清液即为含药血浆。

1.7 血浆药物浓度检测：分述如下。

1.7.1 血浆样品预处理：精密量取血浆100μl，加入500μl乙腈漩涡混匀，5000rpm离心10min，上清液氮气吹干，100μl流动相[0.1%甲酸乙腈（A)∶0.1%甲酸水溶液（B)=24∶76（v/v)]复溶，12000rpm离心10min，取上清液待色谱分析。

1.7.2 对照品溶液的配制：分别精密称取6种对照品适量，分别用乙腈溶解配置为质量浓度为1mg/ml的母液，4℃冰箱保存备用。使用前分别精密吸取一定量的对照品母液，用流动相[0.1%甲酸乙腈（A）∶0.1%甲酸水溶液（B）=24∶76（v/v）]稀释成质量浓度分别为 0.01、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00μg/ml的对照品溶液。

1.7.3 液相色谱条件：Capcell C18色谱柱（250.0mm×4.6mm，5μm），柱温30℃，进样量10μl，流速1.0ml/min。

流动相为0.1%甲酸乙腈（A）∶0.1%甲酸水溶液（B)=24∶76（v/v)，检测波长270nm。

1.8 统计学方法：采用SPSS17.0统计软件进行统计分析，实验数据用±s表示。多组间比较采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 色谱分析和方法学考察：取7份100μl空白血浆，加入不同质量浓度的100μl混标溶液，按1.7.1项下方法操作，在1.7.3项下条件测定，结果见图1。6个主要有效成分线性范围均为0.0100-10.0000μg/ml，回归方程和相关系数（r）：苔黑酚葡萄苷：Y=0.0018X+0.0025，r=0.9993；仙茅苷：Y=0.0716X+0.0025，r=0.9994；朝藿定A：Y=0.2345X+0.0041，r=0.9993；朝藿定B：Y=0.2634X+0.0350，r=0.9997；朝藿定 C：Y=0.1611X+0.0625，r=0.9999；淫羊藿苷：Y=0.0356X-0.0201，r=0.9998。该方法的日内和日间精密度RSD（n=6）均小于5%，血浆经冷藏（－80℃、3d）和反复冻融（3次）后各成分RSD（n=3）均小于10%，平均加样回收率均在85%～105%之间，符合检测要求。

2.2 药动学参数计算和分析：淫羊藿和仙茅配伍前后给药各成分在骨髓炎兔体内的血药浓度-时间曲线见图2。血药浓度数据采用药动学计算软件3p97拟合，采用非房室模型计算药动学参数，灌胃淫羊藿仙茅水提物后，各有效成分在骨髓炎兔体内的药动学参数见表1。

图1 淫羊藿仙茅药对主要有效成分HPLC色谱图

图2 淫羊藿仙茅药对给药后各成分的药时曲线

表1 淫羊藿和仙茅配伍前后淫羊藿苷和仙茅苷的药动学参数比较

3 讨论

骨髓炎合并有死骨形成、成骨活性下降、局部血液循环差等问题，是病灶清除后骨缺损难以修复的重要原因。有研究发现抗生素植入技术结合淫羊藿、仙茅口服给药有较强的抗感染能力和较好的成骨活性，能在病灶彻底清除后，有效发挥骨修复作用。中药配伍可以影响有效成分在体内的吸收和代谢。淫羊藿和仙茅均可温补肾阳，相须为用，相得益彰。本实验研究了淫羊藿仙茅配伍前后6种主要有效成分朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、苔黑酚葡萄糖苷、仙茅苷在骨髓炎兔体内的药动学行为，发现配伍显著影响其在骨髓炎兔体内的药动学行为，使其血药浓度增加，体内清除速率减慢，生物利用度增加，从而促进药物进入病变部位，延长药物在体内的滞留时间，发挥协同增效作用。从药动学角度阐明了仙茅和淫羊藿配伍治疗骨髓炎骨不连的合理性。