初次治疗未治愈丙型肝炎患者远期预后的影响因素及预测指标探讨

皇甫彤,王伟红，何莹，陆长春，蔺永梅，朱丽娜

(1 汉中市三二〇一医院，陕西汉中 723000；2山东省聊城市人民医院；3河北医科大学第四医院)

研究发现，免疫应答及炎症反应水平与肝炎转归有紧密联系[1～3]。白细胞介素10(IL-10)能调控CD8+T细胞的分化，而后者分化不足常引起T细胞衰竭，导致病毒持续高水平表达。Da等[4]发现，白细胞介素12(IL-12)可诱导Th1细胞分化，进而开启免疫应答，参与抗病毒过程。在Komolmit等[5]的研究中，干扰素-γ诱导蛋白10(IP-10)作为CXC类趋化因子，亦可介导Th1型炎症反应，提高机体免疫功能。以上指标均可反映丙型肝炎患者病情变化，具有潜在预测价值，但目前关于IL、IP-10与丙型肝炎患者抗病毒治疗后预后转归的研究并不多见。因此，本文预纳入IL-10、IL-6、IP-10等预后相关指标，探究初次未治愈丙型肝炎患者远期预后的影响因素，为临床决策及干预提供参考。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2013年1月～2014年12月汉中市三二〇一医院因慢性丙型肝炎入院治疗的患者210例，其诊断标准为患者抗-HCV、HCV RNA定性检测均呈阳性，ALT增高(>40 U/L)且时间持续超过6个月。其中男131例、女79例，年龄(46.13±11.19)岁。Metavir F0、F1、F2、F3级患者分别为72、56、45、37例；病程(6.72±3.54)年；合并有糖尿病12例、高血压26例、冠心病8例；ALT、AST、ALB、PTA、ALP、TBil分别为(114.6±8.3)U/L、(52.6±9.4)U/L、(43.2±0.5) U/L、46.0%±18.0%、(92.7±54.5) U/L、(52.1±38.3) U/L；病毒载量为(3.8±0.19)×107copies/mL；基因1型患者77例，2/3型133例。纳入标准：患者入院前均未接受干扰素及免疫调节剂治疗；无干扰素、利巴韦林应用禁忌证。排除标准：合并甲型肝炎、乙型肝炎等其他肝炎病毒感染者；患有药物性肝炎、酒精性肝炎、代谢性肝炎等其他类型肝炎者；参与者均签署有关知情同意书，并获本院伦理委员会批准。

1.2 治疗方法 163例丙型肝炎患者采用聚乙二醇干扰素α-2a治疗， 180 μg，皮下注射，每周1次；利巴韦林(病毒基因2/3型患者800 mg，基因1型患者1 000～1200 mg)，口服，每周1次；持续24～48周。47例丙型肝炎患者采用普通干扰素α-2b治疗，3～5 MU，皮下或肌肉注射，每周3次；利巴韦林800～1 000 mg/d，口服，每周1次；持续24～48周。治疗后，再观察24周。疗效评价：治疗24～48周的疗效评价包括以下指标：病毒学应答：①早期病毒学应答(EVR)：治疗12周时，HCV RNA阴转或定量检测后，降低2个Log以上；②治疗应答(ETR)：治疗结束时，HCV RNA检测阴性；③无应答(NR)：治疗12周HCR RNA较治疗前下降不足2个Log；④持续病毒应答(SVR)：治疗结束后24周，敏感PCR检测HCV RNA为阴性；⑤复发：停止治疗后半年，HCV RNA检测又出现阳性。生化应答：ALT复常，低于正常上限值。

1.3 肝纤维化程度的测定 在B超、CT引导下进行肝穿刺活检，16 G穿刺针由日本八光公司提供，穿刺组织长度>1.5 cm。活检组织由本院病理科3位医师单盲法读片进行评定，同时参考2000年西安会议修订的丙型肝炎防治指南，运用Metavir分级分析肝纤维化程度。

1.4 丙型肝炎血清学相关指标的检测 患者入院后1周内于清晨(禁食8 h以上)抽取肘静脉血5 μL，静置20 min，4 000 r/min分离，-80 ℃冻存备用。采用美国贝克曼库尔特AU5800全自动生化分析仪测定患者常规生化指标；双抗体夹心ELISA法(上海恒远生物科技有限公司)检测血清抗-HCV、IP-10水平；采用放射免疫法测定肝纤维化四项，包括血清透明质酸(HA)、层黏蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、IV型胶原(Ⅳ-C)，试剂盒来自武汉华美生物工程有限公司；采用美国ACL7000全自动血凝仪检测血清凝血酶原活动度(PTA)；采用定量ELISA法(美国Grenier公司)检测血清IL-10、IL-12水平，ELX800全自动酶标仪读取其吸光值并计算其浓度，而后严格按照说明书进行操作。荧光定量PCR法检测HCV RNA载量，试剂盒为上海科华生物有限公司产品。HCV RNA检测过程：分离患者血清，加入等量TRIzol试剂裂，反复振荡混匀，13 000 r/min离心，静置10 min；加入等量异丙醇，离心，分层后弃上清，用75%乙醇(DEPC溶解)清洗，稀释重悬后取15 μL总RNA溶解液进行反应。HCV RNA反应条件：42 ℃ 30 min；95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s(5个循环)；95 ℃变性5 s，60 ℃退火1 min(35个循环)。以GAPDH为内参基因，以双标准曲线法进行定量。

1.5 随访 评价疗效后，选取初次治疗未治愈的患者作为研究对象，进行为其2年的随访，首次随访为疗效评价后1个月，常规检测并记录其生化指标的变化，以后每2个月随访一次，记录患者体征及医生诊断报告。终点事件：复发：Metavir分级下降小于1期。根据随访结果，将出现终点事件的患者定义为预后不良，其余患者定义为预后良好。

2 结果

2.1 临床疗效 210例患者中，SVR为56%(117/210)，复发率及NR获得率分别为3%(4/210)、21%(450/210)。治疗过程中，少部分患者出现流感样症状及血小板降低，未放弃治疗。纳入随访的86例患者，经过临床治疗后，24周复查结果:普通干扰素治疗者SVR、EVR、ETR、NR、生化应答、复发分别为26、32、28、19、22、2例，SVR、EVR、ETR、NR、生化应答、复发者年龄分别为(38.4±12.4)、(41.6±14.3)、(40.5±16.8)、(46.0±13.6)、(42.1±15.0)、(44.4±10.2)岁，HCV基因型1型分别为17、24、20、13、15、1例，治疗前病毒载量分别为8.2×105、5.8×106、5.6×106、7.1×106、5.0×106、6.3×106copies/mL。长效干扰素治疗者SVR、EVR、ETR、NR、生化应答、复发分别为91、133、105、26、98、2例，SVR、EVR、ETR、NR、生化应答、复发者年龄分别为(40.1±10.8)、(42.3±11.9)、(39.7±17.4)、(47.1±15.0)、(41.5±13.6)、(42.7±11.3)岁，HCV基因型1型分别为13、24、21、10、18、1例，治疗前病毒载量分别为9.4×105、4.4×106、5.1×106、6.3×106、4.5×106、6.8×106copies/mL。

2.2 随访结果 86例患者中，失访6例；再次治疗后痊愈或好转59例(预后良好组)，预后不良患者21例(预后不良组)，其中复发患者4例、肝纤维化程度加重患者17例。

2.3 两组临床资料分析 两组干扰素类型、基因型、Metavir分级，血清IL-12、IL-10、IP-10水平及HCV RNA载量，血清HA、Ⅳ-C水平比较，P均<0.05。见表1、2。

表1 两组干扰素类型、Metavir分级及基因型比较[例(%)]

表2 两组血清学检测指标比较

2.4 初次治疗未治愈丙型肝炎患者预后的多因素分析结果 多因素Cox回归分析结果显示，HCV基因型，Metavir分级，血清IL-10、IL-12、IP-10水平及HCV RNA载量是初次治疗未治愈丙型肝炎患者预后的独立影响因素(P均<0.05)。见表3。

2.5 各指标对患者预后的评估价值 血清IL-10、IL-12、IP-10、HCV RNA的ROC曲线下面积(AUC)分别为0.675、0.772、0.785、0.724。IL-10最佳诊断点46.25，敏感性74.3%，特异性69.1%；IL-12最佳诊断点209.66 pg/mL，敏感性80.8%，特异性74.6%；IP-10最佳诊断点337.10 pg/mL，敏感性78.2%，特异性83.9%；HCV RNA最佳诊断点8.6×105copies/mL，敏感性79.0%，特异性72.7%。IL-12与IP-10的AUC较高，运用Logisitc生成概率分布，IL-12联合IP-10的AUC为0.872，高于各指标单独诊断(P均<0.05)，其敏感性81.6%、特异性85.2%。见图1、2。

表3 初次治疗未治愈丙型肝炎患者预后的多因素Cox分析

3 讨论

目前，干扰素联合利巴韦林是治疗丙型肝炎患者的主要方案，除有较好的治愈率外亦能延缓病情进展，改善预后[6]。Squadrito等[7]研究提示，长效干扰素联合利巴韦林的应用使SVR应答率明显提高，可达80%。但在实际临床应用中，受患者年龄、病毒基因型等因素的影响，SVR应答率在50%左右。未能取得SVR的患者需延长治疗周期或直接改用抗病毒药物，对这类患者来说，其远期复发率较高，值得临床关注。与Pariente等[8]的研究不同，笔者未在治疗后24～48周定义终点事件，而选择48周复查后尚未SVR应答的患者进行随访跟踪，主要观察其再治愈及远期随访过程中，导致患者复发及肝纤维化程度加重的危险因素及早期预测指标。

图1 各指标评估患者术后预后的ROC曲线

临床资料显示，初次治疗即达SVR的患者，复发率较低。但初次治疗未愈者，尤其是无应答患者，再治疗的SVR有30%～40%[9]，其复发率及纤维化程度较初次即治愈患者更高，远期预后亦不理想。

图2 IL-12联合IP-10评估患者预后的ROC曲线

本研究120例患者经临床治疗后，SVR获得率为55.7%，与多数报道一致。本研究发现，基因1型对初次治疗未治愈患者预后转归存在影响。因此，对于1型患者，延长用药时长是基础，更需时时检测，及时调整用药方案。

在抗HCV病毒的免疫反应中，Th1/Th2的波动调节着丙型肝炎慢性进展程度及干扰素疗效。IL-12作为Th1反应的重要启动因子，能促使Th1/Th2平衡倾向于Th1分化，激活细胞毒性T淋巴细胞、自然杀伤细胞(NK)的杀伤功能，清除病毒[10]。IL-10则来源于Th2，抑制Th1介导的细胞免疫，导致感染持续存在，与肝炎慢性化有关。初次治疗未治愈丙型肝炎患者中，IL-10的水平较低，IL-12较高，二者检测值的变化可反映患者免疫状态，具有预测疾病转归的潜力。IP-10是新近CXC家族趋化因子，主要由IFN-γ产生，通过募集活化T淋巴细胞、单核巨噬细胞、树突状细胞、NK细胞等强化Th1型反应，细胞免疫随即增强[11]。ROC曲线结果显示，IL-12联合IL-10的预测价值更高，提示二者联合作为初次治疗未治愈丙型肝炎患者预后的预测指标较为理想，在复查患者病毒含量时，应辅助分析患者IP-10、IL-12变化趋势，对IP-10、IL-12较低的患者加以干预，避免停药复发及肝纤维化程度加重。

综上所述，Metavir分级、IL-10、IL-12、IP-10、HCV RNA载量及HCV基因型是影响预后的独立影响因素；IL-12联合IL-10有望作为初次治疗未治愈丙型肝炎患者预后不良的评估指标。