结直肠癌组织中锌指E盒同源结合蛋白-1、赖氨酸酰氧化酶-2的表达变化及意义

何月新,王斌,穆雅,边莲,高立娟

(天津市北辰医院,天津300499)

结直肠癌是消化道常见恶性肿瘤之一。据美国癌症学会统计，结直肠癌在所有确诊的恶性肿瘤中发病率高居第三，且结直肠癌的发病率有年轻化趋势[1]。结直肠癌的治疗手段除传统外科手术切除外，近年化疗、放疗、靶向治疗等方法陆续用于临床，但目前仍以外科手术切除为主[2]。随着影像技术、内镜检查及检验技术的进步，全直肠系膜切除术手术方式的确立，使结直肠癌患者手术切除率可达75%[3]，但由于较高的复发率及转移率，结直肠癌患者远期预后并不乐观。因此探究结直肠癌组织中肿瘤细胞浸润转移的机制，从而找到针对性的防治方法，是改善结直肠癌患者预后的重要手段。锌指E盒同源结合蛋白-1(ZEB1)作为锌指蛋白的一种，参与调控机体的胚胎发育和细胞分化过程[4]。研究[5]发现，ZEB1在多种恶性肿瘤中过表达，且与肿瘤细胞的上皮-间质转化(EMT)密切相关。赖氨酸酰氧化酶-2(LOXL2)属于赖氨酰氧化酶(LOX)家族，能够通过影响肿瘤细胞的微环境，促进肿瘤细胞的浸润转移[6]。本研究利用免疫组化法检测ZEB1与LOXL2的表达情况，结合患者临床资料及术后随访结果，以探究ZEB1、LOXL2在结直肠癌组织中的表达变化及其临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取天津市北辰医院2010年1月～2017年1月收治的结直肠癌患者83例，均经病理检查确诊。取病理科结直肠癌患者癌组织及对应的癌旁组织存档蜡块83例份。纳入标准：癌组织、癌旁组织的石蜡标本保存完整且一一对应；临床病历资料完整；术前未经放、化疗等其他抗肿瘤手段治疗；未合并其他严重疾病。排除标准：患者临床病历资料缺失或石蜡标本缺失；合并其他恶性肿瘤；合并其他影响免疫组化结果的疾病；术前已经放、化疗等其他抗肿瘤手段治疗；失访。其中患者男44例，女39例；年龄34～71(57.31±11.09)岁，<65岁53例，≥65岁30例；经病理科确认，组织分化程度高者30例，中、低程度者53例；TNM分级Ⅰ、Ⅱ级者46例，Ⅲ、Ⅳ级者37例；浸润程度T1、T2者46例，T3、T4者37例；淋巴结转移者38例，无转移者45例。本研究经本院医学伦理委员会批准，患者及家属知情同意。

1.2 组织中ZEB1、LOXL2表达的检测 采用免疫组织化学法。将石蜡组织切片，常规脱蜡、水化，自来水轻柔冲洗，加入柠檬酸钠抗原修复液(上海士锋生物科技有限公司)，微波修复20 min。冷却至室温，PBS洗涤，加入内源性过氧化物酶阻断剂(上海士锋生物科技有限公司)，PBS冲洗3×3 min。加入一抗(美国Gene Tex公司)，4 ℃孵育过夜。次日，将切片放置至室温后，PBS冲洗3×5 min，加入聚合物增强剂(Elivision试剂盒A试剂，上海士锋生物科技有限公司)，室温孵育20 min，PBS冲洗3×3 min。加入酶标抗兔聚合物(Elivision试剂盒B试剂)，室温孵育30 min，PBS冲洗3×3 min。DAB显色(上海士锋生物科技有限公司)，梯度乙醇脱水，常规中性树胶封片。PBS替代一抗作为阴性对照。染色结果判定：本研究结果由两位病理科高年资医师双盲法独立判定。ZEB1染色定位于细胞核，LOXL2染色定位于细胞质。取400倍光学高倍镜下4个视野，每个视野至少含有100个细胞，最终结果取4个视野评分的算术平均值。染色结果评分由两部分组成：染色强度计分：无染色计0分，淡黄色计1分，黄色至黄棕色计2分，褐色计3分；染色数目计分：染色细胞<5%计0分，5%～25%计1分，26%～50%计2分，51%～75%计3分，>75%计4分。最终染色评分为强度计分+数目计分，≥2分则该组织切片的免疫组化结果视为阳性。

1.3 随访 患者出院后，利用电话、电子通讯等手段结合复诊病历对患者及其家属进行随访调查，随访截止于2017年12月，时长11～62个月，中位随访时间为30个月。

2 结果

2.1 结直肠癌组织与癌旁组织中ZEB1与LOXL2的表达比较 结直肠癌组织中ZEB1、LOXL2阳性表达率分别为30.12%(25/83)、75.90%(63/83)，癌旁组织中分别为0(0/83)、13.25%(11/83)，二者比较，χ2分别为29.433、65.932，P均<0.01。

2.2 结直肠癌组织中ZEB1、LOXL2表达与患者临床病理特征的关系 结直肠癌组织中，ZEB1及LOXL2的阳性表达率与患者TNM分期、浸润程度、淋巴结转移相关(P均<0.05)，与性别、年龄、肿瘤组织分化程度无关(P均>0.05)。见表1。

2.3 结直肠癌组织中ZEB1、LOXL2之间的关系 Spearman秩相关检验显示，结直肠癌组织中ZEB1与LOXL2的表达呈正相关(rs=0.348,P=0.001)。

2.4 结直肠癌组织中ZEB1、LOXL2表达与患者预后的关系 将ZEB1/LOXL2阴性组(19例)与ZEB1/LOXL2阳性组(24例)患者随访结果制成Kaplan-Meier生存曲线，见图1。结果显示，ZEB1/LOXL2阴性组术后生存率为63.16%(12/19)，生存时间为(48.37±4.48)个月，ZEB1/LOXL2阳性组患者的生存率16.67%(4/24)，生存时间(32.50±2.85)个月，与ZEB1/LOXL2阳性组比较，ZEB1/LOXL2阴性组生存率高、生存时间长(χ2=8.811,P=0.002；t=14.135,P=0.000)。

表1 结直肠癌组织中ZEB1、LOXL2表达与患者临床病理特征的关系[例(%)]

图1 ZEB1/LOXL2阳性与阴性组的生存曲线

3 讨论

近年，我国居民由于饮食传统、构成变化，结直肠癌的发病率不断升高，每年约有30万新发病例[7]，发病率高居恶性肿瘤第四位，病死率则为第五位[8]。研究[9,10]发现，相较于原发肿瘤位置，患者临床基础情况、肿瘤的TNM分期、组织分化程度和区域淋巴结转移等因素对患者预后影响更大，其中TNM分期、淋巴结转移与其复发密切相关。因此，对结直肠癌复发转移相关机制的研究是提高结直肠癌临床诊疗水平、改善患者预后的关键因素。

EMT是指上皮细胞在特定因素影响下，细胞极性丢失，胞间连接和黏附连接遭到破坏，从而使上皮细胞转化为具有间质细胞特性的特殊细胞，获得一定的浸润性与游走迁移能力[11]。目前认为，EMT不仅与肿瘤细胞的远处转移有关，也同时影响其原位侵袭[12]。一般认为，EMT以E-钙黏蛋白的丢失为主要标志[13]。ZEB1能够通过抑制E-钙黏蛋白的转录表达，降低肿瘤细胞间的黏附力，从而促进EMT进程[14]。近期一项体外研究[15]显示，siRNA抑制ZEB1表达后，骨肉瘤细胞呈现出凋亡增强、迁移受抑制现象。Hanrahan等[16]关于前列腺癌的研究则显示，ZEB1在前列腺癌中同样能够促进肿瘤细胞的EMT，从而增强肿瘤的侵袭力，促进肿瘤局部浸润与远端转移。在乳腺癌中，ZEB1则通过沉默Ngn3基因，促进乳腺癌的发生与恶性进展[17]。本研究发现，ZEB1在结直肠癌组织中的阳性表达率高于癌旁组织中，且与TNM分期、浸润程度、淋巴结转移等与肿瘤侵袭力相关的临床病理参数相关，因此可知ZEB1在结直肠癌中的作用与其他恶性肿瘤中相似，即能够促进肿瘤原位浸润与远端转移。

本研究选择的另一研究对象LOXL2同样是EMT调节因子之一，能够通过与Snail相互作用促进肿瘤细胞EMT作用[18]，同时LOXL2还参与细胞粘连、细胞迁移作用[19]。LOXL2作为分泌型铜依赖氨基酸氧化酶的一种，能够通过催化特定共价蛋白的交联，起到促进细胞外基质中胶原质与弹性纤维的稳定作用，从而影响肿瘤细胞的生存微环境，进而促进细胞的迁移与侵袭[20]。本研究结果表明，LOXL2在结直肠癌组织中的阳性表达率高于癌旁组织，说明LOXL2同样参与结直肠癌的发生。结合患者临床病理参数，LOXL2的阳性表达率与TNM分期、浸润程度、淋巴结转移等相关，表明LOXL2同样能够影响结直肠癌的浸润与转移。

Peng等[21]通过利用miRNA调控基因表达从而发现肺癌组织中ZEB1对LOXL2的表达具有相互促进作用，两者共同作用于肿瘤细胞EMT。本研究中，肺癌组织中ZEB1与LOXL2的表达呈正相关，与此结果可以互相印证，因此ZEB1与LOXL2在结直肠癌组织中具有类似的协同作用。本研究统计随访结果显示，ZEB1与LOXL2表达阳性的患者预后差于表达阴性的患者，表明ZEB1与LOXL2表达阳性预示患者生存率低与生存时间短，提示需要对这类患者加强监护。

综上所述，ZEB1与LOXL2在结直肠癌组织中过表达，且与TNM分期、浸润程度、淋巴结转移密切相关。因此ZEB1与LOXL2可能参与结直肠癌的发生与恶性进展。ZEB1与LOXL2表达阳性提示患者预后较差，需要适当加强监控，合理结合辅助抗肿瘤手段，从而提高患者生存率，延长生存时间。