皮肤鳞状细胞癌细胞中BAG-1表达变化对细胞增殖、凋亡的影响及机制

张佳音,钟咪,饶美荣,曾芬

(无锡市第三人民医院，江苏无锡214041)

皮肤鳞状细胞癌(CSCC)是第二种最常见的非黑色素瘤皮肤癌，为老年人中常见的恶性肿瘤。近年由于人口老龄化和紫外线照射增加，其发病率不断上升[1]。CSCC患者手术预后较好，但是其早期较易被忽视，而晚期CSCC患者肿瘤浸润较深，常伴有淋巴结转移，增加了手术难度，预后较差[2，3]。目前，CSCC发生发展的确切分子机制仍然未知，且尚未有针对CSCC治疗的标准靶向治疗药物及靶点[4]。因此，研究CSCC发生发展的分子机制，进一步寻找CSCC新型生物标志物和治疗靶点，对于提高晚期CSCC患者生存率和改善生存质量具有重要意义。BAG-1是近年Cutress等[5]发现的与Bcl-2蛋白结合的一种新抗凋亡基因，其可以通过与多种细胞靶蛋白相互作用发挥抗凋亡作用，而且通过调控多种信号通路参与细胞的转录、增殖、迁移[6,7]。研究发现，Bcl-2结合抗凋亡基因1(BAG-1)在正常组织中不表达或低表达，而在食管癌、胃癌等多种肿瘤中高表达，并且其高表达与肿瘤细胞的发生发展密切相关[8,9]。皮肤黑色素瘤中BAG-1高表达，可促进细胞增殖和抑制细胞凋亡[10]，但是BAG-1在CSCC中的表达情况及其对细胞增殖和凋亡的影响未见报道。2016年10月～2017年12月，本研究以CSCC细胞株A431以及人正常永生化上皮细胞Hecate为研究对象，旨在研究BAG-1在CSCC细胞系增殖和凋亡中发挥的作用及机制，为发现CSCC基因治疗靶点提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 细胞：人CSCC细胞系A431和人正常永生化上皮细胞Hecate均购自美国ATCC细胞库。细胞培养在37 ℃、5% CO2全湿度培养箱中，A431培养基为10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640，Hecate培养基为10% FBS的DMEM-高糖。DMEM-高糖培养基、RPMI1640培养基、FBS购自美国Gibco公司，MTS细胞增殖检测、细胞周期检测试剂盒、细胞凋亡检测试剂盒、蛋白裂解试剂购自南京凯基生物技术有限公司，逆转录试剂盒、SYBR实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)试剂盒等均购自日本TaKaRa公司。BAG-1、内参GAPDH引物由上海捷瑞生物工程有限公司设计合成，TRIzol购自美国Invitrogen公司，兔抗人BAG-1抗体(ab32109)、兔抗人E3泛素连接酶鼠双微基因2(Mdm-2)抗体(ab170880)、鼠抗人p53抗体(ab26)、鼠抗人Bax抗体(ab32503)、鼠抗人p21抗体(ab109520)、鼠抗人GAPDH抗体(ab8245)及BCA试剂盒购自美国Thermo公司。BAG-1敲减病毒由上海吉凯基因公司包装合成。

1.2 分组及处理 人CSCC细胞系A431细胞呈对数生长期时将细胞铺至六孔板，贴壁24 h后，按说明书将Ploybree与无有效序列的慢病毒空载体(对照组)及BAG-1抑制慢病毒载体(抑制组)感染至细胞中，放至培养箱中培养，12～16 h更换新鲜培养基。

1.3 细胞中BAG-1 mRNA表达的检测 采用qRT-PCR法。采用TRIzol法裂解细胞提取总RNA。将RNA逆转录成cDNA，并进行荧光定量PCR。引物序列:BAG-1: F:5′TGAGAAGCACGACCTTCATGT3′, R: 5′GGAACCCCTATGACCTCTTCA3′;GAPDH:F: 5′ GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT3′, R: 5′GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG3′。以GAPDH为内参基因。每个样品设置3个反应复孔，按两步法进行反应，94 ℃变性，65 ℃左右退火与延伸，分析各样品的循环阈值(Ct)，用2-ΔΔCt法分析各组实验数据。重复实验3次。

1.4 细胞增殖活力的检测 采用MTS法。感染病毒72 h后的各组细胞以每孔1 500个细胞、150 μL培养基接种于96孔板中，每组设6个平行复孔，放至培养箱中培养，分别在铺板后第0、1、2、3、4天，各孔加入MTS工作液30 μL，培养箱中孵育2 h后，扫描酶标仪490 nm波长处测吸光度(OD值)。

1.5 细胞克隆形成能力的检测 采用细胞克隆增殖试验。收集感染病毒72 h后的各组细胞以每孔200个细胞、2 mL培养基接种于6孔板中，每组设3个平行复孔，放至培养箱中培养，培养2周左右，肉眼观察到克隆团时，弃掉培养基，PBS洗3次，甲醇固定15 min，晾干后加入苏木素1 mL染色30 min，双蒸水冲洗后晾干，扫描拍照，计数肉眼可见克隆团。

1.6 细胞周期的检测 采用流式细胞术。收集感染病毒72 h后的各组细胞，每管6×105个细胞，PBS洗3次后，70%乙醇固定24 h，PBS洗2次后，加入PI染色工作液500 μL(PI储存液12.5 μL，RNase储存液5 μL，缓冲液482.5 μL)，混匀后37 ℃温箱中避光孵育30 min。PBS洗1次后，流式细胞仪检测分析各周期细胞数。重复实验3次。

1.7 细胞凋亡率的测算 采用流式细胞术。用无EDTA的胰酶收集感染病毒72 h后的各组细胞，每管1×106个细胞，PBS洗3次后，加入染色工作液500 μL(Binding Buffer 490 μL， PI 5 μL，FITC 5 μL)，混匀后避光室温孵育15 min。PBS洗1次后，流式细胞仪检测分析凋亡细胞百分数。重复实验3次。

1.8 细胞BAG-1、Mdm-2、p53、Bax和p21蛋白的检测 采用Western blotting法。感染病毒72 h后的各组细胞，每孔加入蛋白裂解液500 μL(蛋白酶抑制剂5 μL和磷酸酶抑制剂5 μL)，超声裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min离心30 min，将上清转移至新的EP管中，BCA试剂盒测蛋白浓度，煮沸变性后，每孔50 μg蛋白进行SDS-PAGE电泳，经湿转将蛋白转移至PVDF膜，8%脱脂牛奶封闭2 h，加入Mdm-2、p53、Bax和p21 一抗4 ℃孵育过夜，TBST洗3次后，二抗孵育室温孵育1.5 h，ELC化学发光法曝光条带，扫描拍照。蛋白条带灰度值采用Quantity One V4软件进行分析。结果重复3次。

2 结果

2.1 细胞中BAG-1的表达比较 A431细胞、Hecate细胞中BAG-1 mRNA相对表达量分别为13.10±0.24、1.00±0.10，BAG-1蛋白相对表达量分别为8.54±1.13、1.00±0.10。A431细胞BAG-1 mRNA及蛋白相对表达量均高于Hecate细胞(P均<0.05)。抑制组A431细胞中BAG-1的相对表达量(mRNA 0.24±0.04,蛋白0.36±0.04)低于对照组(mRNA 1.00±0.10,蛋白1.00±0.10)(P均<0.05)。

2.2 各组细胞增殖活力的比较 与对照组相比，抑制组细胞增殖活力降低(P均<0.05)。见表1。

表1 两组不同时间细胞增殖活力比较

2.3 各组细胞克隆形成能力的比较 抑制组细胞细胞克隆团数目[(62.02±12.58)个]高于对照组[(263.11±15.28)个](t=12.410，P=0.028)。

2.4 各组不同细胞周期分布及细胞凋亡率比较 两组细胞周期分布比较差异有统计学意义(F=15.24，P=0.013)。与对照组比较，抑制组G1期细胞百分比高，S期及G2期细胞百分比低(P均<0.05)，细胞凋亡率升高(P<0.05)。见表2。

表2 各组不同细胞周期细胞分布及细胞凋亡率比较

2.5 各组Mdm-2、p53、Bax和p21蛋白表达水平比较 与对照组相比，抑制组p53、p21和Bax蛋白表达增加，Mdm-2蛋白表达减少(P均<0.05)。见表3。

表3 各组Mdm-2、p53、Bax、p21蛋白相对表达量比较

3 讨论

CSCC好发于头面部等被紫外线照射的部位，不仅影响美观，还严重威胁其生命健康[11]。CSCC具有高侵袭性和远处转移的特性，使得标准化疗和放疗对晚期患者的疗效有限，因此一些学者开始研究CSCC的基因组背景，寻找新的治疗CSCC的可行靶标[12]。BAG-1基因位于染色体9p12，其编码的BAG-1蛋白属于抗凋亡蛋白家族成员，为一种多功能蛋白，通过蛋白与蛋白相互作用的方式与核受体激素、丝氨酸/苏氨酸激酶等多种靶分子结合，影响靶分子的功能[13，14]。研究证实，BAG-1在正常组织中多不表达，其表达多在肿瘤中。刘钢[15]研究发现，BAG-1不仅在甲状腺癌组织中的表达高于癌旁组织，并且其高表达与肿瘤分化差、淋巴结转移及高临床分期有关。在结直肠癌中，BAG-1高表达可作为判断肿瘤预后的一个独立危险因素；其在伯基特淋巴瘤细胞中高表达，促进细胞增殖，而在CSCC中的研究未见报道，因此我们以CSCC细胞株A431为工具细胞，以期研究BAG-1在CSCC细胞系中的表达情况，以及是否具有生物学功能。

qRT-PCR、Western blotting法检测结果发现，BAG-1在CSCC细胞系A431中相对表达量高于人正常永生化上皮细胞Hecate，提示BAG-1在CSCC中高表达，可能为CSCC的候选癌基因。进一步我们采用基因敲减效率较高的敲减病毒感染细胞技术，抑制A431细胞中BAG-1基因的表达后，MTS检测细胞活力下降、平板克隆检测细胞克隆形成能力减弱，提示细胞增殖受到抑制。BAG-1为具有促进细胞增殖的驱动基因，细胞周期紊乱和失控会导致细胞异常增殖，进而导致肿瘤发生，CSCC也不例外，由此我们采用流式细胞仪检测BAG-1对CSCC细胞周期的影响，发现抑制BAG-1后，G1期细胞增多，与Enthammer等[10]研究结果类似，即干扰BAG-1的表达，可通过将黑色瘤细胞阻滞在S期而抑制细胞的增殖。BAG-1是凋亡相关基因。Wang等[16]研究发现，BAG-1在顺铂诱导的肺腺癌细胞凋亡中发挥重要作用，本研究中我们同样检测了BAG-1对CSCC细胞凋亡的影响，结果显示抑制BAG-1的表达后细胞凋亡增多，表明BAG-1对CSCC细胞周期增殖和凋亡均有作用。

明确了BAG-1在CSCC细胞中发挥的具体生物学效应，我们进一步研究其作用的机制。p53基因是较早发现的最重要抑癌基因之一，与细胞周期的调控、细胞凋亡、细胞分化等生物学功能密切相关。在正常生命活动中细胞内的p53蛋白含量较少，当细胞受到外界刺激存在DNA损伤时，应激信号会触发细胞的p53蛋白含量增多，引发下游信号一系列变化，与细胞周期调控通路有关的p53/p21会使细胞阻滞在S期，进行DNA损伤的修复，以维持细胞正常周期进行，如DNA损伤修复失败，则启动与凋亡有关调控通路；p53/Bax促进异常细胞的凋亡，而原癌基因激活或有害因素持续刺激时，细胞内p53蛋白含量调节失控，不能发挥其正常生理作用而导致细胞周期紊乱、细胞凋亡异常。本研究结果显示抑制BAG-1表达后，细胞中p53、p21、Bax蛋白表达增多，表明BAG-1通过p53信号通路调节CSCC细胞增殖与凋亡。研究报道，p53主要被Mdm-2调节，Mdm-2可通过泛素化降解p53蛋白量和直接抑制p53的转录活性。同时Mdm-2与p53结合形成一个精密的负反馈调节环，即其与p53形成p53-Mdm-2复合物，抑制p53介导的抑癌作用，而p53则能促进Mdm-2蛋白合成，参与细胞周期调控、细胞生长及凋亡等过程。本研究中抑制BAG-1的表达，Mdm-2表达减少，p53蛋白表达增多，表明BAG-1调控Mdm-2是p53介导的CSCC细胞增殖和凋亡的关键基因。

综上所述，BAG-1在CSCC细胞中高表达，通过调控Mdm-2/p53信号通路促进细胞增殖和抑制细胞凋亡，本研究为CSCC发生分子机制研究提出新的实验室依据，为CSCC的防治提供了新的干预靶点。