日照地区某鸡场鸡源性大肠杆菌的分离培养及药敏试验

薛涛 赵晗 徐国敬 许崇新 王瑞松 （山东省莒县店子集畜牧兽医站 276522）



日照地区某鸡场鸡源性大肠杆菌的分离培养及药敏试验

薛涛 赵晗 徐国敬 许崇新 王瑞松 （山东省莒县店子集畜牧兽医站 276522）

本试验的目的在于研究禽类体内的大肠杆菌的分离鉴定并对分离出来的大肠杆菌进行药敏试验来分析耐药性。本试验对采集到的某养殖场的20份泄殖腔拭子进行分离鉴定，革兰氏染色，确定了16株大肠杆菌，采用NCCLs推荐的纸片扩散法(Kirby Bauer氏法)对其进行了9种药敏试验，鸡源大肠杆菌对头孢噻肟、庆大霉素敏感，对氧氟沙星、阿莫西林中度敏感，对多环丙沙星、恩诺沙星、萘啶酸、四环素、复方新诺明已产生了耐药性。结果可对禽类大肠杆菌病临床合理用药具有指导意义。

鸡 大肠杆菌 分离鉴定 药敏试验

近几年，随着国家经济水平的稳步增长，人们消费水平的提高，对于肉蛋奶用量的需求量逐步增加。相对应的畜牧行业的发展也逐步加快，禽类农产品占有一定比例。禽类的肠道内含有大肠杆菌，但能够引起禽类致病的是具有毒力的菌株称为致病性大肠杆菌。致病性大肠杆菌成为近来危害禽类主要的细菌性疾病，给禽类生产造成损失[1]。

大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli，又称大肠埃希氏菌)是由德国Escherich于1885年首次从婴儿粪便中分离得到的，是人类和动物临床上重要的致病菌，是近年来食品卫生、用水卫生及流行病学领域的研究对象之一[2]。它是革兰氏阴性菌，单一或成对存在，多为杆状，无芽孢，两端钝圆，多有鞭毛，能运动，有的还含荚膜。大肠杆菌属于兼性厌氧菌，最适合的生长条件为37℃和pH 7.2~7.4[3]。致病性大肠杆菌根据不同的生物学特性可分为5类：肠致病性大肠杆菌(EPEC)、肠产毒性大肠杆菌(ETEC)、肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)、肠出血性大肠杆菌(EHEC)、肠黏附性大肠杆菌(EAEC)。该菌对热的抵抗力较强，55℃加热60min或60℃加热15min部分细菌仍能存活。在自然界的水中可存活较长时间，该菌在温度较低的粪便中能存活数月。大肠杆菌能合成维生素B和维生素K，正常栖居条件下不致病；若进入胆囊、膀胱等处可引起炎症。在水和食品中检出，可认为是被粪便污染的指标[4]。根据O、K、H抗原的不同，可将大肠杆菌菌株分为不同的血清型。一些特殊血清型的大肠杆菌对人和动物有病原性，尤其对婴儿和幼畜(禽)，常引起严重腹泻和败血症。

大肠杆菌的临床症状不太明显，由于致病性大肠杆菌类型的不同和鸡的生长期、生理机能和免疫状态等的差异，发生的疾病也有所不同。从20世纪60年代开始就被Gross 、Smith 和 Nakamura等人依次证实[5]，临床上有以下几种表现型:急性败血型、内脏型、大肠杆菌性肉芽肿、神经型(脑炎型)、关节炎或足垫肿型、生殖型(输卵管炎和卵黄性腹膜炎型)。其中这些表现型中危害最严重的是急性败血型和生殖型(输卵管炎和卵黄性腹膜炎)。并且多并发或继发于其它病毒性或细菌性疾病[6-7]，如继发于新城疫或传染性支气管炎。

在日照地区，畜禽的饲养过程中，养殖户会大量使用抗生素进行疾病的治疗和增强免疫力，而这个过程往往造成了大肠杆菌在药物的选择压力作用下，产生耐药性，使疾病更加难以治疗。由于鸡的大肠杆菌病在临床上频发，其不分日龄，不分季节的流行特点和病程较长的发病特点给养殖户造成了很大困扰，许多人容易病急乱投医，可能造成适得其反的效果。这些都表明养殖上需要科学的理论依据作指示，本论文对日照地区某鸡场鸡源性大肠杆菌进行了生化鉴定和药敏试验，为了掌握该鸡场大肠杆菌的耐药现状，旨在为指导该鸡场临床科学、合理、有效用药，防治大肠杆菌感染提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源 日照地区部分规模化养鸡场泄殖腔拭子。

1.1.2 试剂 营养琼脂、LB营养肉汤培养基、麦康凯琼脂培养基(Maconkey Agar)为北京路桥技术有限责任公司产品；三糖铁琼脂为青岛高科园海博生物技术有限公司产品；乳糖、葡萄糖、麦芽糖、蛋白胨水、葡萄糖磷酸盐胨水、枸橼酸盐均、硫化氢为杭州天和微生物试剂有限公司产品；药敏纸片(阿莫西林，四环素，庆大霉素，头孢噻肟，氧氟沙星，环丙沙星，恩诺沙星，萘啶酸，复方新诺明)为杭州天和微生物剂有限公司产品；细菌微量生化反应管、95%乙醇、30%甘油、草酸铵结晶紫溶液、革兰氏碘溶液、石炭酸复红、0.9%生理盐水等试剂。

1.1.3 仪器 光学显微镜、分光光度计(上海跃进医疗器械一厂)、万用电炉(龙口市先科仪器公司)、生物洁净工作台(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)、电热恒温培养箱(PYX-DHS-60X75-B上海跃进医疗器械厂)、电子天平(上海跃进医疗器械一厂)、ZDX-35BI座式自动电热压力蒸汽灭菌锅(上海申安医疗器械厂)、DHG—9023A箱电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏试验设备有限公司)。

1.1.4 培养基的配置 （1）LB营养肉汤培养基：取25.0g溶解于1000ml蒸馏水中，加入20%~30%的甘油，用玻璃棒搅拌加热至溶解，分装，121℃高压灭菌15min，备用。（2）麦康凯琼脂：取55.0g溶于1000ml蒸馏水中，加热煮沸溶解，115℃高压灭菌20min备用。（3）三糖铁琼脂(TSI)培养基：将64.5g溶于1000ml蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，分装试管，121 ℃高压灭菌15 min，制成高层斜面备用。（4）营养琼脂(Nutrient Agar)：取33.0g于1000ml蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，121℃高压灭菌15min，冷却至46℃左右制成平板或者斜面备用。

1.2 方法

1.2.1 采样 用灭菌的棉签缓缓插入鸡的泄殖腔内，旋转数下，然后将其放入灭菌的装有生理盐水和LB肉汤的10ml离心管内，折断手持部分，做好标记，放入冰盒保存。

1.2.2 细菌的分离与培养 在超净工作台内点燃酒精灯对工作台进行消毒，将装有棉拭子的离心管放到37℃恒温箱内解冻。在酒精灯火焰附近用接种环沾取菌液接种到麦康凯培养基内，采取三区划线法接种细菌，注意不要划破琼脂表面。接种完后放入恒温培养箱中37℃培养24h。用接种环挑取培养基上画线区线上生长较好的单菌落，接种到营养琼脂上。将营养琼脂放入37℃恒温箱内培养18h。

1.2.3 细菌的纯化与保存 用接种环从培养基画线上挑取粉红色生长较好的单个菌落接种于普通营养琼脂培养基上纯化培养，37℃培养16~18h。用封口膜封好缝隙，放入冰箱内低温保存，以备后用。在灭菌的离心管内加入1000μl的营养肉汤，用灭菌的棉签涂抹营养琼脂上的菌落混入肉汤中，用封口膜封口，标签纸写上编号，放入冰箱内低温保存。

1.2.4 细菌的革兰染色及镜检 取干净无油渍的载玻片，通过火焰过火，确保载玻片灭菌干净。用灭菌接种坏取少量生理盐水，至于玻片中央，接着用接种环挑取一个大肠杆菌单菌落于生理盐水中搅匀，均匀涂成大小合适的薄层。自然晾干并用火焰固定。初染，将草酸铵结晶紫溶液滴加于干燥、固定好的抹片上，放置1~2min后水洗干净；媒染，滴上革兰氏碘溶液，在2~3min后水洗干净；然后用95%乙醇进行脱色，在1min后进行水洗；继续用石炭酸复红进行复染，过3min后用水洗干净；最后经过自然晾干后，再进行镜检，即可观察视野中细菌的形态。

1.2.5 细菌的生化鉴定 将所保存的菌放入37℃恒温箱内解冻，用无菌接种环接菌到生化管内和三糖铁斜面上。三糖铁琼脂接种先涂布斜面后穿刺底部，放入37℃恒温箱内培养18h。观察各生化管颜色变化。当生化试管变色后，取出蛋白胨水和葡萄糖磷酸盐胨水，在蛋白胨水内加入先加入乙醚再加入吲哚。葡萄糖磷酸盐胨水用VP(Voges-Proskauer)法，先加入甲液(6%甲萘酚酒精溶液)再加入乙液(40%氢氧化钾)。

1.2.6 细菌的药敏试验 在超净工作台内配得菌液于离心管中。利用紫外分光光度计将菌液浓度调至108cfu/ml。采用K-B纸片扩散法进行药敏试验[8]。将营养琼脂培养基平板用记号笔标记划分为四区。用微量移液器吸取菌液100μl，小心滴于培养基表面中央位置。用无菌涂布棒，将沿一个方向将菌液涂布于培养基平面，改变原来的方向沿垂直方向来回推动涂布，重复多次使菌液分布均匀。室温下静置5~10min，使菌液浸入培养基内。用无菌小镊子分别夹住环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、萘啶酸、头胞噻肟、四环素、庆大霉素、复方新诺明、阿莫西林药敏片的边缘按一定的布局贴在相应区域的中间位置。轻轻按压使其固定，药敏纸片一旦接触平板就不可再移动。作好记录后置于恒温箱中37℃培养18~24h。通过抑菌直径来评定抑菌效果。直径越大说明该药物对菌株的抑菌效果好，菌株对该药物敏感。测量抑菌圈直径，取其平均值。不同药物的判定标准参照临床和实验室标准化研究所(CLSI)推荐的标准[9]，见表1。

表1 各种抗菌药物纸片含药量及药敏试验结果判定标准

2 结果与分析

2.1 细菌的生化试验结果

大肠杆菌能发酵葡萄糖、麦芽糖、乳糖均产酸。MR试验结果菌株均为阳性，吲哚试验为阳性，VP试验结果为阴性，TSI试验为阳性，枸橼酸盐试验为阴性，表示不能利用枸橼酸盐。TSI试验阳性，斜面和底层均为黄色，底部有气泡产生，确定的为4、6、9、10不是大肠杆菌。结果表2。

表2 细菌生化鉴定结果

注：“＋”阳性反应，“－”阴性反应，“⊕”阳性产气

2.2 细菌分离率

通过分离培养，20份样品中分离出16株大肠杆菌，细菌分离率为80%。

2.3 药敏试验结果

对20株菌株进行药敏试验，由表3的数据与表1结合起来得到表4，根据判定标准为耐药率=耐药菌株数／测量菌株数×100%，敏感率=敏感菌株数／测量菌株数×100%[9]，由此可知菌株对四环素(60%)耐药，大部分对环丙沙星(50%)、恩诺沙星(50%)、萘啶酸(64.3%)、复方新诺明(61%)耐药；对头孢噻肟(92%)、庆大霉素(81%)高度敏感。

表3 药敏试验结果 (mm)

表4 药敏试验结果分析

3 讨论

3.1 细菌分离培养及鉴定分析

（1）通过细菌分离培养，鸡源大肠杆菌在在麦康凯培养基上形成粉红色菌落。对纯化后的细菌进行革兰氏染色，染色后为红色，生物显微镜下观察细菌形态为短小的杆状，多单个存在，少数成对出现。通过以上结果可初步确定所鉴定菌种为革兰氏阴性杆状菌。对纯化好的细菌进行生化鉴定试验。因为不同种类的细菌对糖的分解利用能力不同，糖发酵试验以能否分解某种糖，是否产酸产气等现象来鉴别细菌[10]。大肠杆菌能分解葡萄糖、麦芽糖和乳糖，产酸。本糖发酵试验中葡萄糖、麦芽糖均为阳性，乳糖有2株菌株为阴性，其余大多数为阳性，属于正常情况，可视其结果为阳性。大肠杆菌不能利用枸橼酸盐，故在此培养基上不能生长，培养基仍为绿色。本枸橼酸盐利用实验有一株菌株的结果为阳性，其他均为为阴性，可能是操作过程中污染了杂菌的原因。吲哚Indor试验、MR试验结果过均为阳性，VP试验结果均为阴性，TSI试验有2株为阴性，其他为阳性，视其结果为阳性。生化鉴定试验的结果符合大肠杆菌的生化特性，进一步确定所鉴定的样品为大肠杆菌。（2）在试验过程中有时会因为操作步骤的不规范产生一些杂菌，这主要因素有以下几点：①倒培养基时，锥形瓶的瓶口与培养皿壁有接触，手碰触培养皿的边缘，使杂菌粘到锥形瓶瓶口处，导致锥形瓶内的培养基被污染。②在使用生物洁净工作台时，没有先开紫外灯灭菌直接进行接菌操作，使空气中的杂菌落入培养基内，影响试验结果。③在进行保菌处理使用移液器时，移液枪头碰到已经高压灭菌的离心管的管壁，污染了保存的菌液。在进行生化试验时，加入试剂的时间长短，可以影响生化试验结果的显示。如在做VP试验时，加入试剂5min内生化管上部分会变成黑色，等到15min之后生化管呈现粉红色，在1h后生化管呈现橘红色。在不同时间段内，生化管的颜色变化就给试验结果的判定带来了影响。根据试验结果来看，分离出的菌株的生化试验结果多为阳性，且符合大肠杆菌的生化特性，所以可以判定为分离出的18株菌株为大肠杆菌。

3.2 药敏试验耐药性的分析

（1）由药敏试验结果表3、表4可知从20株菌株中分离出的16株菌株对环丙沙星耐药率50%、中介率14.3%、敏感率35.7%，恩诺沙星耐药率35.7%、中介率28.6%、敏感率35.7%，氧氟沙星耐药率14.3%、中介率14.3%、敏感率74.1%，萘啶酸耐药率64.3%、中介率14.3%、敏感率21.4%，头孢噻肟耐药率0%、中介率14.3%、敏感率85.7%，四环素耐药率57.1%、中介率为21.4%、敏感率为21.4%，庆大霉素耐药率7.1%、中介率14.3%、敏感率78.6%，复方新诺明耐药率57.1%、中介率28.6%、敏感率14.3%，阿莫西林耐药率28.6%、中介率7.1%、敏感率64.3%。由此可以看出来14株鸡源大肠杆菌菌株全部对头孢噻肟庆大霉素高度敏感，对其他药物都有一定的耐药性，其中对氧氟沙星、复方新诺明、阿莫西林较敏感。从表3还可以知道，大多数菌株对所有药物都有一定的耐药性，即表现为不同的多重耐药现象，还有交叉耐药现象。（2）从结果可以看出来，鸡源大肠杆菌对临床上较少使用的药物较敏感，较多使用的药物有耐药性，而且对广谱抗菌药的耐药性也在增加。这说明大肠杆菌对药物的适应能力越来越强，产生耐药性的速度也越来越快。所以临床使用药物时不能为了提高抗生素的治疗效果就频繁的换药，另外从交叉耐药上这一点来看不能随便将几种药物混合使用。正是因为在实际药物应用的时候没有按照药物规范标准使用，才使得应用时药物剂量不足，或者为了防止某些禽类疾病随便往禽类适量里添加抗菌药物，从而导致禽类体内的大肠杆菌对某些药物出现耐药性。（3）随着我国养禽业现代化、集约化的发展，大量的抗菌药物被投用于作为细菌感染的首选药物，抗菌药物的不合理使用和滥用的情况严重，导致家禽体内和饲养环境中的大肠杆菌的耐药性逐渐升高，药物的作用能力逐渐降低，养殖场只能延长药物使用的时间、加大投放药物的剂量和选择更新的药物(头孢类)解决药力降低的问题，导致大肠杆菌在大强度的抗菌药物压力作用下，产生更高的耐药性，甚至出现多重耐药的现象。当前部分养殖场，为了节约饲养成本，多数在饲料和饮用水中加入抗生素来预防疾病的发生，但这种盲目的防治措施恰恰增大了细菌耐药性产生的可能。目前研究最多的是食源性家畜和家禽，从食源性动物中分离的大肠杆菌可能是耐药因子在人体和环境互相转移的重要媒介，当食源性的耐药菌转移到人体内，会对人的健康造成威胁。

本试验结果和研究资料表明，大肠杆菌的耐药现象已经非常普遍，应当加强这方面措施控制耐药性升高的趋势。首先在对禽类进行药物使用之前，应该进行药物的敏感性分析，禁止滥用药物。依据药敏试验结果选择使用相应的抗菌类药物，并且要严格按照说明来决定使用剂量的多少，从而降低鸡源大肠杆菌对抗生素产生耐药性的几率。另外，临床用药时也可与其他药物配伍使用，多采用联合用药、交叉用药等方式，从而来提高抗生素的治疗效果。同时也可以用中药来进行辅助，中药具有毒副作用小，无耐药性产生等优点。

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（2018–6–20）

S852.61+2

A

1007-1733(2018)06-0008-04