国槐花活性多糖抗氧化和免疫增强作用的研究

李卓悦 冯玉祥 张洪影 于忠芳 李可 闫振贵 （山东农业大学动物科技学院 山东 泰安 271018）



国槐花活性多糖抗氧化和免疫增强作用的研究

李卓悦†冯玉祥†张洪影 于忠芳 李可 闫振贵*（山东农业大学动物科技学院 山东 泰安 271018）

本研究旨在探讨国槐花多糖的体外抗氧化活性和免疫增强作用，为国槐花药品和功能食品的开发提供参考依据。采用水提醇沉法从国槐花干粉中提取粗多糖，并经除蛋白、脱色素等处理获得精制国槐花多糖，其总糖含量为56.75%，蛋白含量为1.57%；选取小鼠为动物模型，研究国槐花多糖对正常小鼠免疫机能的影响，结果表明，与正常对照组小鼠相比，国槐花多糖能提高小鼠的胸腺指数、脾脏指数、外周血淋巴细胞的增殖能力和血清抗体效价，其中高剂量组均达到显著水平；体外抗氧化试验表明，国槐花粗多糖对DPPH•和H2O2具有较强的清除能力，且其清除率具有剂量依赖性；因此，国槐花多糖具有较好的抗氧化性和免疫增强活性。

国槐花 多糖 免疫增强 抗氧化

槐花又名槐蕊，是豆科植物槐的干燥花蕾或花朵，味苦、性微寒,归肝、大肠经。槐花含有多种生物活性物质和营养成分，是具有显著临床疗效的天然药物，具有清热泻火等作用，其水煎剂及提取物还有抗菌、抗炎、抗病毒、凝血、止血、影响心血管系统等作用。

上世纪初，国内外研究确定槐花中含有多糖、蛋白质、氨基酸、植物甾类、鞣质及微量元素等多种化学成分。曹小燕等[9]以秦巴山区野生槐花为试验材料，采用单因素试验结合正交实验方法建立了纤维素酶－超声辅助提取槐花多糖的工艺条件。王丽华等[4]采用四因素三水平正交试验设计, 获得了槐花水溶性多糖提取的最佳工艺条件。赵庆友等[5]研究表明，不同剂量槐花多糖均能提高雏鸡的免疫器官指数，并且提高雏鸡免疫新城疫疫苗后的抗体水平和外周血T淋巴细胞转化率。然而，有关国槐花多糖的提取纯化及抗氧化、免疫调节等生物活性的研究鲜有报道。因此，本研究拟从国槐花干粉中提取国槐花多糖，研究国槐花多糖的抗氧化及免疫调节活性，为国槐花干粉的应用、天然安全食品抗氧化剂、免疫增强剂的开发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒 鸡新城疫病毒(ND)

1.1.2 试验动物及生物制剂 5周龄健康雄性洁净级小鼠，购自泰安泰邦生物公司；国槐花瓣，收集自泰山周边新鲜的国槐花瓣；小鼠外周血淋巴细胞分离液，购自天津灏洋生物有限公司；红细胞裂解液，购自康为世纪有限公司。

1.1.3 主要化学试剂 无水乙醇、丙酮、乙醚、苯酚、MTT试剂等均为国产分析纯。

1.1.4 仪器 高速冷冻离心机，型号CR21GII(日本日立公司)；JA1203A电子天平(上海精天电子仪器有限公司)；电热恒温培养箱(山东潍坊医疗器械厂)；电热恒温水槽，型号DK-8D(上海精宏实验设备有限公司；太仓精宏仪器设备有限公司产品)；QL-901漩涡震荡仪(澳门市其林贝尔仪器制造有限公司)；WD-9406B水平摇床(沃德生物医学仪器公司)。

1.2 方法

1.2.1 国槐花多糖的提取和纯化 采用水提醇沉法提取国槐花多糖，称取200g干燥至恒重的国槐花干粉，置索氏提取器中，加入石油醚，水浴回流脱去脂肪；将除脂的国槐花粉末与去离子水按1:15(W：V)的比例混合，在85℃条件下用蒸馏水反复浸提3次，合并滤液，离心，去除沉渣，取上清液，然后浓缩至原体积的1/4；待浓缩液冷却后，缓慢加入3倍体积的无水乙醇并搅拌混匀，4℃静置过夜；次日，经低温离心，得到醇沉后的絮状沉淀，沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚各洗涤两次，最后用少量去离子水将多糖沉淀溶解，冻干，即得国槐花粗多糖。称取适量国槐花粗多糖，经Sevage法除蛋白、双氧水法除色素，并进行透析、洗涤等处理后，获得精制国槐花多糖[1]。

1.2.2 国槐花多糖总糖和蛋白含量的测定 （1）总糖的测定：采用苯酚硫酸法[2]测定国槐花多糖的的含量。配制葡萄糖标准品溶液，准确称取20mg葡萄糖，用纯水定容至100 mL。将标准品溶液进行稀释，得到浓度梯度为 30、50、100、150、200µg/ml的系列溶液。准确吸取1.0ml标准品溶液，依次置于5支具塞试管内，然后分别加入0.5ml 5%的苯酚溶液和2.5ml浓硫酸，轻摇混匀，25℃放置20min后，用分光光度计于490nm处测定吸光度值。以标准品溶液浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。国槐花多糖中糖含量的测定方法与标准品相同，将干燥恒重后的多糖配制成溶液，按照以上方法操作，于490nm处测定吸光度值，根据标准曲线计算多糖含量。（2）蛋白含量的测定：采用Bradford 法[3]测定国槐花多糖中蛋白含量。用1.0mg/ml浓度的牛血清白蛋白(BSA)标准工作液稀释为0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mg/ml的BSA标准液。分别取2ml，加入3ml考马斯亮蓝G-250试剂，混匀，2min后，在595nm下测定其吸光度，绘制标准曲线，并计算其标准曲线回归方程。配置0.5mg/ml的多糖样品溶液，依据上述方法测定吸光度后，代入方程计算样品的蛋白质含量。

1.2.3 动物实验设计 5周龄雄性昆明小鼠64只，随机分成4组，每组2笼，每笼8只。分组及各组剂量如下：第I组为高剂量组，每只小鼠按400mg•kg-1的剂量皮下注射国槐花多糖；第II组为中剂量组，每只小鼠按200mg•kg-1的剂量皮下注射国槐花多糖；第III组为低剂量组，每只小鼠按100mg·kg-1皮下注射国槐花多糖，第IV组为空白对照组，皮下注射生理盐水；连续注射7d。在第8d，所有小鼠皮下注射免疫1羽份的ND疫苗。分别在免疫后7、14、21d采集样品，采样前12h内，小鼠禁食不禁水。

1.2.4 国槐花多糖对小鼠免疫机能的影响 （1）免疫器官指数：免疫后7、14、21d，各组随机取5只小鼠，称重及采血后剖杀。分别摘取胸腺、脾脏并称重，计算免疫器官指数(g/kg) =免疫器官重量/活体重。（2）血清抗体效价的检测：免疫后7、14、21d，采集各组小鼠的血液，分离血清，采用β半微量血凝抑制(HI)法测定血清抗NDV抗体效价，HI抗体效价以Log2X表示[6]。

1.2.5 国槐花多糖对小鼠外周血淋巴细胞增殖的影响 采用倍比稀释的方法用RPMI1640培养液将国槐花多糖溶液(1mg/ml)依次稀释至0.977µg/ml，总共8个浓度梯度。每个时期对小鼠眼球采血2ml，肝素抗凝。将血样1倍稀释并混匀，缓慢加到淋巴细胞分离液上层，离心。小心吸取中间云雾状淋巴细胞层并用Hank's液洗涤两次，离心，再使用红细胞裂解液除去淋巴细胞团中的红细胞杂质，台盼蓝染色计数活细胞数大于90%后，用RPMI1640培养液稀释细胞至每毫升1.5×106个，每孔加多糖100µl，各浓度3孔，另设细胞对照孔。于细胞培养箱中培养24h后，各孔加MTT试剂30μl，用酶联免疫仪检测570nm处的吸光度值。若多糖组的吸光度值显著大于对照组，则表明多糖能显著促进淋巴细胞增殖[7]。

1.2.6 国槐花多糖的抗氧化作用的研究 （1）国槐花多糖对DPPH的清除能力的测定 参照已有方法并略作修改，配置浓度为0.1mmol/L的DPPH•乙醇溶液。分别取 0.5ml不同浓度的国槐花多糖溶液样品，加入2.0ml DPPH•乙醇溶液，然后加入1.5ml去离子水充分混匀，快速振荡，在室温下避光放置30min后，采用分光光度计于517nm处测定吸光度，以抗坏血酸(Vc)作为阳性对照，每个样本重复三次，取平均值[8]。（2）国槐花多糖对H2O2清除能力的测定：参考现有方法并略作修改，将国槐花多糖配置成不同的浓度梯度。取15ml的玻璃试管，分别加入2.4ml 0.1mol/L的磷酸缓冲液(pH7.4)和0.6ml 40mM的H2O2溶液，然后分别加入1ml的国槐花多糖溶液，混匀，剧烈震荡，对照不添加国槐花多糖溶液，于室温下放置10min，在230nm下测定吸光度值，每个样本重复3次。以水替代国槐花多糖溶液，作为对照实验。抗坏血酸(Vc)用作阳性对照。每个样本重复3次，取平均值。

2 结果与分析

2.1 国槐多糖的提取及测定结果

用水提醇沉的方法，国槐花粗多糖的得率为12.13% (w/w)。纯化的国槐花多糖经苯酚硫酸法测定的总糖含量约为56.75%，Bradford法测定的蛋白含量为1.57%, 表明国槐多糖可能是一种蛋白结合型多糖。

2.2 国槐多糖对小鼠体重的影响

由表1可见，在免疫后的第7d，3个多糖组(I、II、III)的小鼠体重均高于对照组(IV)，其中，第I组(高剂量组)的小鼠体重显著高于对照组(IV)；而在免疫后的第14和21d，第I、II、III组的小鼠体重与对照组(IV)差异不显著(P>0.05)。

表1 国槐花多糖对小鼠体重的影响 （g）

注：同列数值后标有不同字母表示差异显著(P<0.05)，下表类同。

2.3 国槐花多糖对小鼠免疫机能的影响

2.3.1 免疫器官指数 由表2可见，在免疫后的第7、14和21d，第I、II、III组的胸腺指数均高于第IV组，其中第I组(高剂量组)的胸腺指数显著高于对照组(IV)；另外，脾脏指数的变化规律与胸腺指数类似。

表2 国槐花多糖对小鼠免疫器官指数的影响

2.3.2血清抗体效价 由表3可见，在免疫后7、14和21 d，第I、II和III组的效价均高于第IV组，其中，第I组显著高于第IV组(P<0.05)；另外，第I组的效价均高于第II和III组，但差异不显著(P>0.05)第IV组，结果表明，国槐花多糖能显著小鼠免疫NDV后的血清抗体效价。

表3 国槐花多糖对免疫NDV小鼠血清抗体效价的影响 (Log2)

2.4 国槐花多糖对小鼠外周血淋巴细胞增殖的影响

由表4可见，在免疫后7、14和21 d，与第IV组(空白对照)相比，第I、II和III组均显著促进淋巴细胞的增殖(P<0.05)，其中，第I组的增殖效果显著高于第II和III组，(P<0.05)。

表4 国槐花多糖对小鼠外周血淋巴细胞增殖的影响

2.5 国槐花多糖体外抗氧化效果

2.5.1 国槐花多糖对DPPH•的清除能力 由图1可见，在一定浓度范围内，国槐花粗多糖对DPPH• 自由基有一定的清除能力，其清除DPPH• 自由基能力随着国槐花粗多糖浓度的增加而逐渐增强，但是其清除率远低于作为阳性对照的Vc。

图1 国槐花多糖对DPPH的清除能力

2.5.2 国槐花多糖对H2O2的清除能力 由图2可见，在一定范围内，国槐花粗多糖对H2O2具有较强的清除能力，且其清除率随着国槐花粗多糖浓度增加而逐渐增强。作为阳性对照的Vc对H2O2具有很强的清除能力，浓度为1mg/mL时，其清除率就已在90%以上。

图2 国槐花多糖对H2O2 的清除能力

3 结论

本研究发现，国槐花多糖能促进小鼠免疫系统的发育，提高其生长性能，其中高剂量组的效果最显著；对小鼠的外周血淋巴细胞具有增殖作用，其中高剂量组效果最好；不同浓度的国槐花多糖均能提高小鼠的抗体水平，其中高剂量组最显著；国槐花多糖具有较好的体外抗氧化能力，在一定范围内随浓度增加而增强。

[1] 姜波, 王艳颖, 刘长建等. 银杏叶多糖提取、纯化及其含量的测定[J]. 时珍国医国药, 2007(11): 2729-2731.

[2] 谢建华, 谢明勇, 聂少平等. 苯酚-硫酸法测定青钱柳中多糖含量[J]. 食品工业, 2010, 31(4): 93-95.

[3] 黄婉玉, 曹炜, 李菁等. 考马斯亮蓝法测定果汁中蛋白质的含量[J]. 食品与发酵工业, 2009, 35(5): 160-162.

[4] 王丽华, 李元瑞, 陈懿等. 姬松茸多糖脱蛋白方法的研究[D]. 西北农林科技大学: 西安, 2003.

[5] 赵庆友. 泰山槐花多糖的提取及对鸡兔免疫增强作用的研究[D]. 山东农业大学: 泰安, 2012.

[6] 闫振贵. 不同途径免疫NDV弱毒苗诱导鸡体黏膜和系统免疫反应的研究[D]. 山东农业大学: 泰安, 2011.

[7] 颜爱, 李波, 李润成等. 香菇多糖和黄芪多糖对免疫抑制小鼠免疫功能调节的研究[J]. 中国免疫学杂志, 1000-484X(2012)11-0999-04.

[8] 邹林武, 赵谋明, 游丽君. 香菇多糖提取工艺的优化及其抗氧化活性研究[J]. 食品工业科技, 2013, 34(19): 177-182.

[9] 曹小燕, 杨海涛. 槐花多糖提取工艺优化及自由基清除活性研究[J]. 北方园艺, 2016(13): 141-146.

（2018–09–19）

山东省2016年度自然科学基金面上项目(ZR2016CM26)；国家级大学生创新创业项目(201710434201)；动科院“双一流”学科经费

S816.7

A

1007-1733(2018)06-0001-03

†共同第一作者；