血清PZ水平及FG79A基因多态性与急性缺血性脑卒中的关系

刘景祎，李富慧，张保朝

(南阳市中心医院神经内科，河南 南阳 473000)

急性缺血性脑卒中的发生，能够显著增加患者的病死率。长期的流行病学研究显示，急性缺血性脑卒中的发病率可达344～556/10万人左右[1]，在合并有高血压或者糖尿病等的人群中，急性缺血性脑卒中的发病率具有进一步的上升趋势。

不同的生物学因子的改变，能够引起局部血管内皮细胞的损伤，增加粥样斑块的形成，导致血管平滑肌的痉挛等，促进缺血性脑卒中的发生[2]。血清蛋白质Z（PZ）是重要的凝血因子相关蛋白，其表达浓度的改变能够通过抑制凝血因子的激活，抑制血小板性血栓的形成，稳定局部血流动力学，降低缺血性脑卒中的发生风险[3，4]。部分研究已经探讨了PZ蛋白在缺血性脑卒中中的异常表达情况，认为高表达的PZ蛋白是减轻患者颈部动脉狭窄、降低粥样斑块形成的重要因素，但对于PZ蛋白的基因多态性的分析研究不足。本研究进一步探讨PZ蛋白的表达及其FG79A基因多态性与急性缺血性脑卒中的关系，从而为临床上患者的病情评估提供参考。

1 资料与方法

1．1 一般资料 选取2015年1月至2017年12月在我院治疗的急性缺血性脑卒中患者157例 （观察组），纳入标准：⑴诊断符合《中国急性缺血性脑卒中诊治指南》中的标准；⑵发病到入院时间＜24h；⑶患者及家属知情同意。排除标准：⑴合并有恶性肿瘤、自身免疫性疾病、肝肾功能不全等疾病；⑵检查前已接受凝血、抗纤溶等治疗。同时选取健康志愿者160例作为对照组，观察组和对照组受试者一般资料比较差异无统计学意义 （P＞0.05），见表 1。

表1 两组一般资料比较

1.2 血清指标检查 采集空腹静脉血约5ml，自然抗凝后以3000r/min离心10min，取上清液采用酶联免疫吸附法测定PZ蛋白水平，检测试剂盒购自北京中杉金桥生物有限公司，具体检测步骤严格按照试剂盒说明书进行操作；凝血功能指标的检测采用凝固法在全自动血凝仪中进行FIB、PT和APTT等的检测，PUN-2048系列半自动凝血分析仪购自日本Sysmex集团。

1.3 聚合酶链反应（PCR）检查 基因多态性检测：取冻存的血清保存液体，按照10000r/min的离心速度进行离心分离，每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，进行裂解操作，4℃冰上采用无酶的RNA冲洗液进行洗涤，再次10000r/min离心5min，得到RNA。混合液在加入逆转录酶MMLV之前先70℃干浴3min，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶0.5μl，37℃水浴60min，室温放置5min使其完全溶解，使其逆转录为cDNA。以β-actin为模版，在反应体系中加入SYBR Green 1染料、上游引物、下游引物、dNTP，使得总体积达20ul，上机，反应条件为：93℃ 2min、93℃ 1min、55℃ 2min，共 40 个循环。

PCR产物扩增后进行基因多态性检测：参考multiplexkit试剂盒（南京凯基生物科技有限公司）使用说明，加入各位点对应延伸引物进行单碱基测序反应。并在ABI1310（Life Technologies，美国）进行电泳，结果用GENEMAPPER软件（Life Technologies，美国）进行分析。

引物序列：上游引物5-AACACCATAGACAGAGTCCGATATTCGC-3，下游引物5-ATGAACTCGGCATTAGAACATGGTTGGAA-3 1.4统计学处理 统计分析采用SPSS 19.0软件，计量资料采用（±s）表示，两组间比较使用t检验，多组间比较使用方差分析，两两比较采用LSD-t检验；计数资料比较使用χ2检验；相关性采用Pearson相关分析；采用Hardy-Weinberg平衡检验各组基因型分布情况。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 观察组和对照组血清PA以及凝血参数水平比较 观察组PZ明显低于对照组（P＜0.05），而FIB明显高于对照组（P＜0.05）；观察组和对照组PT和APTT差异比较无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 观察组和对照组血清PA以及凝血参数比较

2.2 观察组不同病情患者血清PA以及凝血参数水平比较 根据脑卒中临床神经功能损伤程度（NDS）评分表对脑梗塞严重程度进行分型，轻型（NDS评分≤15分）64例， 中型 （NDS评分16～30分）57例，重型（NDS评分≥31分）36例；重型患者PZ明显低于轻型和中型患者（P＜0.05），而FIB明显高于轻型和中型患者 （P＜0.05）；不同病情患者PT和APTT差异比较无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 观察组不同病情患者血清PA以及凝血参数水平比较

2.3 相关性分析 将患者血清PZ水平与凝血参数进行相关分析，结果显示血清PZ与FIB呈负相关（r=-0.871，P＜0.05）。 见图 1。

图1 相关分析图

2.4 观察组和对照组PZ内含子F中G79A多态性分布 观察组和对照组FG79A基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律；观察组和对照组FG79A基因型和等位基因分布比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表 4。

2.5 观察组不同FG79A基因型患者血清PZ水平比较 GG型患者血清PZ水平明显高于AG型和AA型（P＜0.05）；AG型患者血清PZ水平明显高于AA 型（P＜0.05）。 见表 5。

3 讨论

临床上急性脑卒中患者的病死率较高，通过包括改善微循环、抗凝或者神经营养类药物治疗后，患者的神经功能损伤表现虽然有所改善，但治疗后的病情缓解率仍然较低，治疗后的中枢神经系统功能评分如美国国立卫生研究院卒中量表(National Institute of Health stroke scale)等仍然无明显的改善。越来越多的研究显示，凝血因子相关功能的改变，可能是促进血管内皮损伤，增加椎动脉动脉痉挛、狭窄和脑组织缺血程度的重要因素[5，6]。

PZ蛋白结构上包含了多个巯基结合区域，其能够通过对于末端的修饰作用，抑制血小板表面受体的激活，抑制血小板的活化程度，降低血小板性血栓的形成风险。PZ蛋白对于凝血因子Ⅴ的激活，能够抑制内源性凝血因子的激活，降低局部纤维蛋白溶解酶的上调程度，减轻局部血管内皮下纤维组织的沉积，并稳定早期发病过程中纤维蛋白溶解系统的激活过程[7]。近年来相关基础方面的研究显示，PZ蛋白能够在影响到缺血再灌注损伤、微循环障碍、脑血管疾病的发生、细胞凋亡等方面发挥作用，能够抑制恶性肿瘤及感染性疾病的发生[8]，从而发挥保护性的作用[9]。而对于PZ蛋白与缺血性脑卒中的相关研究显示，PZ蛋白能够稳定内皮下胶原蛋白的暴露过程中的凝血因子的激活，平衡凝血-抗凝过程，降低血栓的形成风险，改善脑血管的临床结局[10]。而本次研究在探讨了PZ蛋白的表达差异的同时，揭示了PZ蛋白FG79A基因型的差异与缺血性脑卒中患者的关系。

本研究通过血清学指标的分析研究发现，在缺血性脑卒中患者血清中存在相关指标的显著低表达，其中PZ蛋白的阳性表达率可显著下降，同时患者病情越严重，PZ蛋白的表达下降越明显，提示PZ蛋白的异常表达可能参与到了缺血性脑卒中的病情进展过程中[11，12]：⑴PZ蛋白的低表达，失去了其对于发病早期体内凝血因子的抑制作用，导致凝血因子Ⅶ、凝血因子Ⅲ等因子的表达浓度明显上升；⑵PZ蛋白的低表达，导致患者体内的纤维蛋白的溶解增多，体内凝血因子从高凝期转为消耗性低凝期的速度明显增快。汤荣华等[13]研究者在探讨了82例样本量的缺血性脑卒中患者的血清学资料后发现，PZ蛋白的阳性表达率可平均下降25%以上，同时患者的DIC发生风险越高，体内血栓的形成率越高，血清中PZ蛋白的表达浓度上升越为明显。纤维蛋白原(plasma fibrinogen，FIB)浓度是评估患者体内的凝血因子的重要指标，过度激活的凝血过度增加了纤维蛋白的合成及释放，提高血清中FIB的浓度，过度上升的FIB在短期内对于凝血功能的维持具有一定的稳定作用，持续性上升的FIB可以增加血栓的形成风险，增加脑梗塞的发生可能[14]。相关性分析也可以发现，PZ与FIB呈负相关，提示二者可能具有一定内在关系，PZ蛋白能够通过对于增加对于交联蛋白酶原的分解作用，其与FIB的释放呈正相关。FG79A基因型在病例组或者正常对照人群中并不具有统计学差异，提示FG79A基因型的差别并不会影响缺血性脑卒中的发生，但可以发现FG79A基因型中G等位基因的差别，能够影响到血清PZ蛋白水平，这主要考虑与维生素K酶、钙离子结合的糖蛋白酶的激活作用有关，从而增加了PZ等抑制性蛋白的合成[15]。

表4 观察组和对照组FG79A多态性分布

表5 观察组不同FG79A基因型患者血清PZ水平比较

综上所述，血清PZ在急性缺血性脑卒中明显降低，与病情严重程度呈负相关，同时G79A基因多态性与血清PZ水平有一定关系。