γδT细胞及其产生的IL-17A在急性川崎病患儿中的改变及临床意义

刘志强，彭宇，邹峥，柯江维

(江西省儿童医院，江西 南昌 330006)

川崎病（Kawasaki disease，KD）又称为皮肤黏膜淋巴结综合征 （mucocutaneous lymphnode syndrome，MCLS），是一种以全身性血管炎为主要病理改变的疾病，最常见于5岁以下小儿，病理变化为全身性中小动脉血管炎，其中冠状动脉最易受累，大量流行病学资料显示川崎病已取代风湿热成为发达国家儿童后天性心脏病最主要的病因[1]。临床上以持续发热、口唇潮红、球结膜充血、手足硬肿脱屑等皮肤、粘膜和淋巴结的炎性症状为主要表现。KD的病因和发病机制尚不明确，有学者提出，可能是由于感染原激发机体产生非特异性淋巴细胞或非特异性抗体，破坏受累动脉内皮细胞，激发异常炎症反应，进而引起一系列的病理改变和临床表现[2]。本研究旨在探讨γδT细胞及分泌的白细胞介素 （interleukin，IL）17在KD中的表达及其意义，为临床诊断和治疗提供理论依据。

1 材料和方法

1．1 一般资料 选取2015年3月至2017年9月来我院风湿免疫科治疗的川崎病患儿123例作为病例组，其中男77例，女46例，平均年龄2．6岁。入组标准：符合川崎病或不完全川崎病诊断标准[3]。另选同时期来我院门诊体检的健康儿童69例作为对照组，其中男40例，女29例，平均年龄2．8岁。两组间儿童性别、年龄比较差异无统计学意义(P＞0．05)。本研究经医院伦理委员会批准，且征得家长的同意并签署知情同意书。

1．2 主要仪器和试剂 FACSCantoⅡ流式细胞仪（美国BD公司），TD5A－WS离心机（湖南赛特湘仪离心机仪器离心机有限公司），MK－3酶标仪（美国赛默飞世尔科技有限公司），Iwo－960洗板机（安图实验仪器有限公司），THERMO恒温孵育箱 （美国赛默飞世尔科技有限公司）。PE anti－human TCRγδ（美国 BD 公司），Alexa Fluor 488 偶联 anti－human IL－17A McAb （美国 BD 公司），PerCP anti－human CD3 McAb（美国 BD 公司），Human IL－17A ELISA Kit、Human TGF－β1 ELISA Kit(杭州联科生物科技股份有限公司)。

1．3 研究方法

1．3．1 外周血 γδT17细胞的分析 研究对象入院时采集静脉血2ml，肝素抗凝，淋巴细胞分离液分离出单个核细胞，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液调整细胞密度为2×106/ml，取1ml细胞悬液铺至24孔细胞培养板内，且每孔加入豆蔻酰佛波醇乙酯(终浓度 50ng/ml)、莫能菌素(终浓度 10μg/ml)及离子霉素 (终浓度1μg/ml)吹打均匀，置于37℃、5%CO2条件下的细胞培养箱内培养5h。收集培养后的细胞于流式上样管中，1000r/min离心5min，洗涤后PBS重悬。取30μl细胞悬液加入到另一流式上样管中，分别加入PerCP anti－human CD3 McAb 和 PE anti－human TCRγδ 各 5μl进行胞膜染色，室温避光孵育20min；PBS洗涤后加入胞膜固定剂和破膜剂，再加入Alexa Fluor 488偶联 anti－human IL－17A McAb， 室 温 避 光 孵 育20min，PBS洗涤后加入500μl PBS重悬细胞。同时设立阴性对照组和同型对照组；流式细胞仪上机检测，所有数据采用FACSDiva软件进行分析。

1．3．2 血清 IL－17A、TGF－β1 测定 研究对象入院时用普通管采集静脉血1ml，3000r/min离心3min，分离得到血清，置－80℃冰箱保存。采用酶联免疫吸附实验检测血清IL－17A和TGF－β1表达水平。实验操作严格按照试剂盒步骤要求进行。

1．4 统计分析 采用SPSS 19．0软件进行统计学分析，结果采用均数±标准差表示，组间差异采用单因素t检验，以P＜0．05表示差距有统计学意义。

2 结果

2．1 两组受试者外周血 γδT细胞含量的比较 γδT细胞在病例组外周血CD3+T细胞中的比例（11．24±2．31） 显著高于正常对照组比例 （7．09±0．63）（P＜0．05）。 见表 1。

表1 两组间γδT细胞含量的比较（±s）

表1 两组间γδT细胞含量的比较（±s）

组别病例组对照组t值P值γδT%123 69 n 11．24±2．31 7．09±0．63 14．18＜0．05

2．2 两组受试者血清IL－17A含量的比较 IL－17A在病例组血清中的含量（11．19±3．48ng/l）显著高于对照组中的含量（4．41±1．09ng/l）（P＜0．05）。 见表 2。

表2 两组间外周血IL-17A水平比较（±s）

表2 两组间外周血IL-17A水平比较（±s）

组别病例组对照组t值P值IL－17A(ng/l)123 69 n 11．19±3．48 4．41±1．09 15．29＜0．05

2．3 病例组和对照组血清TGF－β1含量的比较TGF－β1 在病例组血清中的含量 （9．31±1．84ng/ml）显著高于对照组中的含量 （6．93±1．37ng/ml）（P＜0．05）。见表 3。

表3 两组间外周血TGF-β1水平比较（±s）

表3 两组间外周血TGF-β1水平比较（±s）

组别病例组对照组t值P值TGF－β1(ng/ml)123 69 n 9．31±1．84 6．93±1．37 9．35＜0．05

2．4 两组受试者外周血 γδT17细胞含量的比较γδT17细胞在病例组外周血CD3+T细胞中的比例（3．68±1．70）显著高于对照组（1．25±0．53）（P＜0．05）。见表4。

表4 两组间γδT17细胞含量的比较（±s）

表4 两组间γδT17细胞含量的比较（±s）

组别病例组对照组t值P值γδT17%123 69 n 3．68±1．70 1．25±0．53 11．51＜0．05

3 讨论

目前对于川崎病的病因和发病机制尚不明确，流行病学研究显示，KD发病过程中至少存在一种感染因素启动了异常的免疫反应[4]。KD急性期会导致免疫系统的高度激活，从而导致免疫细胞因子的高度活化，启动细胞因子瀑布反应，引起血管内皮出现炎症性损伤[5]。免疫系统的高度活化及免疫损伤性血管炎是KD的显著特征。

T细胞是免疫细胞的主要组分，它具有多种生物学功能，如直接杀伤靶细胞，辅助或抑制B细胞产生抗体，对特异性抗原和促有丝分裂原的应答反应以及产生细胞因子等。根据T细胞受体(T cell receper，TCR)受体不同，T细胞主要分为αβT和γδT细胞。γδT细胞的排列方式不同于其它细胞，是由TCR-γ和TCR-δ组合而成[6]。γδT根据分子结构和功能不同又可分为不同的亚型。在免疫应答的早期阶段，γδT细胞通过诱导DC成熟在固有免疫和适应性免疫中起着桥梁作用，被视为“免疫系统的第一道防线成员”[7]。研究发现哮喘患者的γδT细胞相对于健康人来说呈现增加趋势，提示γδT细胞参与了哮喘的发生[8]。妊娠糖尿病患者γδT细胞在外周血PBMC及CD3+T细胞中的比例增高，提示疾病发生影响和改变了T细胞亚群的分布[9]。γδT细胞还可作为APC活化T淋巴细胞，并且辅助B细胞产生抗体，启动特异性免疫应答。我们的研究显示，相比于健康对照儿童，KD患儿γδT细胞的比例显著增加。回顾患儿病史，患儿多在发热持续3至5d左右就诊，此时患儿尚处于疾病早期。γδT细胞是一类重要的固有免疫细胞，它们能快速地 （数小时内）启动宿主体内的免疫应答，并且只需少量细胞就能发挥重要作用。因此，我们认为γδT细胞在KD患儿发病早期发生了高度活化，γδT细胞参与了KD早期的炎症过程。

IL-17A是一种促炎因子，主要由T淋巴细胞诱导合成，是T淋巴细胞诱导的炎性反应的早期启动因子，它能够募集中性粒细胞，促使T淋巴细胞活化，还可以诱导上皮细胞、内皮细胞合成与分泌IL-6、IL-8等刺激因子，加重局部炎症反应[10]。王振杰[11]等研究发现风湿免疫相关性血细胞减少症患者血清IL-17、IL-12表达水平均高于正常对照组；提示介导自身免疫的IL-17等炎性因子的表达水平与风湿免疫相关性血细胞减少症患者的造血细胞炎性受损相关病变程度密切相关。在关于系统性红斑狼疮和溃疡性结肠炎的研究中亦发现，相对于健康对照儿童，病例组患儿血清IL-17明显升高，且与疾病活动密切相关[12，13]。转化生长因子 β（transforming growthfactor-β，TGF-β）是一种以抑制免疫为主的负向调节因子，TGF-β1是TGF-β在体细胞系中含量最高、活性最强的一种亚型，可通过抑制炎性细胞的功能和促进调节性T细胞的产生，发挥免疫抑制作用，稳定机体免疫平衡[14]。然而Peters[15]等研究证实肺纤维化时IL-17通过诱导TGF-β和胶原蛋白产生直接促进肺纤维化。我们研究发现，与健康对照儿童相比，KD患儿血清IL-17A和TGF-β1的含量显著增高，高水平的IL-17A和TGF-β1与KD的发病密切相关。推测IL-17A作为促炎因子参与了KD发生，对其浓度进行监测，可以为KD的炎症干预提供有效指导。血清TGF-β1水平升高可能是IL-17A诱导所致，即IL-17A作为促炎因子参与了KD的炎症反应的同时，可能又诱导了抑炎因子TGF-β1的产生，其机制和功能还有待进一步证实。

γδT细胞具有多种生物学效应，其中最主要的是溶解靶细胞的细胞毒活性和分泌不同种类的细胞因子和趋化因子。IL-17A作为一种重要的炎症介质，早期的研究认为其主要是由Th17细胞产生，但近些年的研究发现CD8+T细胞和多种固有免疫细胞如γδT细胞、NK细胞、NKT细胞等也能够产生IL-17A[16]。γδT细胞作为产生IL-17的重要T细胞，与Th17细胞有一些共同的特征，不同之处在于γδT细胞可通过Toll样受体直接与某一病原体相互作用[17]。在某些情况下，γδT细胞产生IL-17的能力比Th17细胞更强。在一些自身免疫性疾病的小鼠模型中，给予完全弗式佐剂后，γδT细胞是最早且大量产生IL-17的细胞。有报道，由γδT细胞产生的IL-17在对肺分枝杆菌卡介苗感染和卡介苗诱导的肺肉芽肿的免疫反应中起着重要作用。薛春雪[18]等研究发现，γδT细胞可能以γδTCR非依赖的方式活化，并且通过释放IL-17A参与H1N1重症感染小鼠早期肺组织的炎性损伤过程。我们研究发现，相对于健康对照组，γδT17细胞比例在病例组中明显升高。所以，我们认为对于KD的发病，γδT细胞和血清IL-17A都扮演着重要角色，且此时血清中的IL-17A浓度的升高很大程度上是由于产生IL-17A的γδT细胞增多所致，这与Corpuz等[19]的研究进一步证实γδT细胞是IL-17的重要来源这一结果基本一致。至于此时是否还伴有分泌IL-17A的其它细胞如：Th17细胞、NK细胞等细胞数量上的改变还不清楚，有待进一步研究。

γδT细胞是一类特殊的T细胞，细胞亚群众多，生物学效应多样。目前在小鼠模型的研究中证实产生IL-17的γδT细胞与多种感染及自身免疫性疾病的发生、发展密切相关。γδT17细胞的生物学特性、在疾病中的作用及作用机制还了解很少，相信随着对γδT17细胞的研究日益深入，γδT17细胞的应用也将会有更广阔的前景。