延黄牛ALDH1A1基因多态性及其与体尺和肉质性状的相关性研究

胡忠昌，曹 阳，吴 健，金海国，赵玉民*

（1.吉林省农业科学院畜牧科学分院，吉林公主岭 136100；2.延边大学农学院，吉林延边 133002）

延黄牛是我国经过27年选育而成的优秀肉牛品种，具有适应性强、生长速度快、产肉率高等优点，是具有鲜明地域特点和朝鲜族特色的高档肉牛品种[1-2]。

乙醛脱氢酶1A1（Acetaldehyde Dehydrogenase 1A1，ALDH1A1）为乙醛脱氢酶（ALDHs）基因超家族成员之一，该基因位于人的第19号染色体的长臂21区31亚区，主要存在于肝脏[3]、晶状体[4]、脑组织、视网膜[5]和胃肠道黏膜上[6]。据统计，ALDH1A1基因的蛋白质分子质量约为54.86 ku，推测总原子数目达到7 700个，而半衰期可达到30 h，蛋白质结构稳定，是亲水性蛋白质，其不稳定系数小于30，平均疏水性值约为-0.16[7-8]。在动物肝脏中ALDHs能将醇类化合物氧化成对应的醛类[9]。Wang等[10]研究发现，ALDH1A1基因可以通过调控视黄醛信号通路的升高而促进葡萄糖和脂质的氧化。Park等[11]在小鼠中研究发现沉默ALDH1A1基因能使视黄醛毒性在癌症细胞中减少。ALDH1A1基因在脂肪细胞分泌调节中也发挥重要作用，能够通过交感神经元促进白色脂肪组织的生长和神经支配，且显著刺激体内和体外轴突神经的生长[12-13]。目前，关于ALDH1A1基因的研究还局限于人类癌症方面，而作为重要的脂肪酸代谢调控基因，在寻找可行性遗传标记SNP位点方面至今还未见报道。鉴于此，本研究以16月龄延黄牛母牛为实验对象，利用Sanger直接测序的方法检测ALDH1A1基因多态性，分析其与延黄牛体尺、肉质性状的关联性，为开展延黄牛肉质候选基因筛选的工作提供理论基础和科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 随机抽取16月龄的99头延黄牛母牛（吉林省珲春市吉兴牧业有限公司提供），采集延黄牛耳组织约1.5 g，放入含有75 %乙醇的2 mL离心管中，标记好牛号和时间带回实验室提取DNA。

1.2 主要试剂及仪器 AxyPrep基因组DNA提取试剂盒购自Axygeno公司，2XES Taq MasterMix购自CWBIO公司，超微量分光光度计Quawell-Q5000购自北京鼎盛生物技术有限责任公司，PCR仪T100购自上海伯乐生命医学产品有限公司。

1.3 基因组DNA的提取 根据AxyPrep基因组DNA提取试剂盒说明书提取99头延黄牛牛耳组织基因组DNA，采用Quawell-Q5000超微量分光光度计检测DNA的浓度及纯度，并取3 μL进行电泳定性检测DNA。

1.4 DNA引物设计及合成 根据 GenBank 中发表的牛ALDH1A1基因DNA序列（登录号：NW_003104101.1），通过UCSC查找基因外显子，共发现ALDH1A1基因含有13个外显子，用Primer5.0设计引物，引物信息见表1。引物均由苏州金唯智生物科技有限公司合成。

1.5 PCR反应体系及条件 PCR反应体系（20 μL）：2×Taq Master Mix10 μL，DNA 1 μL， 上、 下 游 引 物 各 0.5 μL，ddH2O 8 μL。PCR反应条件：95 预变性2 min；95变性30 s；退火（见表1）30 s，72 延伸30 s，共34个循环；72 终延伸5 min，产物4 保存。

1.6 延黄牛ALDH1A1基因多态性检测 对99头延黄牛DNA样品进行PCR扩增，每个取 3 µL进行电泳检测，剩余PCR产物由苏州金唯智生物科技有限公司Sanger直接测序。利用DNAman软件对测序结果逐一进行分析寻找SNP位点，用Chromas对测序结果波峰图进行分析，统计并计算基因型和基因型频率。

1.7 统计分析 利用 SPSS 19.0软件进行单因素方差分析，以确定单个基因型与肉用性状的相关性。结果以平均值±标准差表示，以P＜0.05为差异显著性判断标准。1.8 基因（型）频率及遗传多态性统计分析 通过基因（型）频率计算遗传纯合度（Ho）、遗传杂合度（He）、有效等位基因数（Ne）和多态信息含量（PIC）。

表1 引物序列信息

式中，n为等位基因数；Pi、Pj为第i、j个等位基因频率。PIC＜0.25为低度多态；PIC＞0.5为高度多态；0.25＜PIC＜0.5为中度多态。

2 结 果

2.1 延黄牛ALDH1A1基因PCR扩增 PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测结果发现，ALDH1A1基因第4外显子片段长度约为443 bp，与预期扩增片段大小一致（图1）。

图1 延黄牛ALDH1A1基因第4外显子PCR产物电泳图

2.2 序列分析 对测序结果的分析比对发现，仅在ALDH1A1基因第4外显子编码区发现G/T突变，其余外显子未发现突变（图2），利用Chromas软件对测序结果波峰图依次比对确定ALDH1A1基因第4外显子基因型，与 GenBank（登录号：NW_003104101.1）序列反向互补相同序列的定义为TT基因型，杂合子为TG基因型，未发现GG基因型（图3）。该突变导致氨基酸酪氨酸（Y）发生改变（图4）。

2.3 延黄牛ALDH1A1基因遗传学分析 对ALDH1A1基因第4外显子TT和TG基因型进行分析发现，TT和TG的基因型频率分别为79.80 %和20.20 %，TT为优势基因型；T和G基因频率分别为89.9 %和10.1 %，T为优势等位基因（表2）。由表3可知，ALDH1A1基因第4外显子T/G突变位点的He相对较低，表明其在延黄牛群体中的变异较小；PIC为0.166（PIC＜0.25），表现为低度多态，说明上述遗传标记能够提供少量的遗传信息。

图2 延黄牛ALDH1A1基因第4外显子序列比对结果

图3 TT和TG的测序波峰图

图4 ALDH1A1基因第4外显子氨基酸序列与原氨基酸序列比对图

表2 延黄牛ALDH1A1基因第4外显子基因型频率及其基因频率

表3 ALDH1A1基因4号外显子在延黄牛上的遗传特性

2.4 延黄牛ALDH1A1基因第4外显子不同基因型与体尺、肉质性状的相关性分析 如表4所示，ALDH1A1基因第4外显子不同基因型与延黄牛体尺性状中的十字部高、胸围、腹围和管围存在显著相关（P＜0.05），与肉质性状中的背膘厚存在显著相关（P＜0.05），与肌内脂肪具有一定的相关性（P＞0.05）。

3 讨 论

乙醛脱氢酶超家族（ALDHs）可以通过编码一类NAD（P）+依赖的酶，将外源性和内源性的醛类脂肪族和醛类芳香族氧化为相应的羧酸[14]。ALDH1A1作为该家族中的重要一员，在视黄醛代谢和维甲酸代谢通路的活化中发挥着重要的作用，还是脂类代谢通路的关键基因。本研究在延黄牛ALDH1A1基因第4外显子处发现T/G突变，TT为优势基因型（79.80%），T为优势等位基因（89.90%），该位点的突变引起氨基酸Y（酪氨酸）的改变，而酪氨酸是一种非必需氨基酸，是构成蛋白质的主要氨基酸，即参与生糖反应也参与生酮反应，推测TT基因型可能是影响延黄牛脂肪酸代谢的关键基因型。但是该突变位点的He相对较低，表明其在延黄牛群体中的变异较小；PIC为0.166（PIC＜0.25），表现为低度多态，说明该遗传标记能够提供少量的遗传信息[15]。TT基因型是否是影响延黄牛脂肪酸代谢的关键基因型，还需要进一步扩大样本数量进行系统的分析。通过对ALDH1A1基因第4外显子不同基因型与延黄牛体尺和肉质性状相关联分析发现，ALDH1A1基因第4外显子不同基因型与延黄牛体尺性状中的十字部高、胸围、腹围和管官围存在显著相关，与肉质性状中的背膘厚存在显著相关，与肌内脂肪具有一定的相关性。Gagaoua等[16]通过反相蛋白阵列（RPPA）定量了29个蛋白质生物标志物，发现ALDH1A1基因与牛肉质鲜嫩和多汁有关，并被证实为牛肉质的主要生物标志物。Moreb等[17]采用寡核苷酸微阵列分析的方法对肺癌细胞系中基因谱的变化进行分析，发现ALDH1A1基因与脂质代谢、细胞增殖、迁移和粘附有关。更有学者通过研究小鼠和人细胞发现，ALDH1A1和ALDH1A3是癌症干细胞（CSC）和正常组织干细胞（SC）的标志物，并且参与细胞的自我更新、自我分化和自我保护[18]。ALDH1A1基因第4外显子多态性是否对延黄牛体尺和肉质性状有影响，是否能作为一个肉质改良的标记，还需要进一步深入研究。本课题组下一步将验证该基因是否对延黄牛皮下脂肪细胞有影响。

表4 延黄牛ALDH1A1基因第4外显子不同基因型与肉质性状的相关性分析结果

目前，ALDH1A1的研究只局限于人类癌症[19]、代谢性疾病和神经性疾病[20]方面，对脂肪酸代谢、视黄醛代谢和维甲酸代谢通路的影响尚未深入研究。本研究通过对延黄牛ALDH1A1基因多态性进行检测及其与延黄牛肉用性状的关联分析，为今后延黄牛肉质改良有效遗传标记的筛选提供参考依据。

4 结 论

本研究对延黄牛ALDH1A1基因13个外显子进行SNP位点检测，经分析在第4外显子处检测到T/G突变，且引起编码氨基酸的改变，但该突变位点的He相对较低，在延黄牛群体中的变异较小，属于低度多态（PIC＜0.25），仅能提供少量遗传信息。关联分析结果显示，ALDH1A1基因第4外显子不同基因型与延黄牛体尺性状中的十字部高、胸围、腹围和管围存在显著相关，与肉质性状中的背膘厚存在显著相关，与肌内脂肪具有一定的相关性。综上所述，ALDH1A1基因外显子在延黄牛中存在多态性，且与延黄牛体尺和部分肉质性状存在显著性差异，能否作为延黄牛肉质和体尺性状的遗传标记有待于扩大样本数量进一步验证。