脊髓HMGB1/ NF-κB参与雷公藤红素对慢性炎症痛大鼠的镇痛作用*

张秀梅 赵文平 刘星芳 黄志华 单热爱,4△ 黄 诚△

( 赣南医学院 1第一临床医学院；2第一附属医院麻醉科；3生理学教研室；4疼痛医学研究所，赣州 341000)

慢性炎症痛在临床中常见，在中国，遭受慢性疼痛困扰的人口达35.9%，严重影响病人的工作能力和生活质量，给社会带来巨大的经济负担[1]。目前临床上一些镇痛药物在一定程度上能达到较好的镇痛作用，但其中有一大部分病人并未得到足够有效的镇痛治疗。基于此，研究出更多治疗慢性炎症疼痛的药物意义重大。

雷公藤红素(celastrol, Cel)，是来源于雷公藤根皮的三萜类化合物，是雷公藤中最主要的活性成分之一[2]。研究发现雷公藤红素在抗炎、免疫抑制、抗肿瘤及神经衰退性疾病等治疗方面都表现出较好的疗效[3]。在足底注射角叉菜胶致小鼠炎症痛模型中，给予Cel腹腔注射治疗能明显改善小鼠的机械痛敏行为[4]。在CFA诱导的关节炎大鼠模型中，腹腔给予Cel(1 mg/kg)可明显减轻大鼠足底肿胀，关节组织HE染色及免疫组化结果显示经Cel治疗后可消除炎症浸润，减少免疫细胞增殖。体外实验结果证明Cel可明显抑制NF-κB的激活，减少IL-1β、IL-6及TNF-α的分泌[4,5]。研究表明，脊髓胶质细胞介导的神经炎症反应在慢性疼痛中发挥重要作用[6,7]，Cel能否通过抑制神经炎症缓解慢性炎症痛尚未见报道。

在本实验中发现雷公藤红素对CFA诱发的慢性炎症痛具有显著的镇痛作用，为此，进一步深入研究雷公藤红素对慢性炎症痛的可能镇痛分子机制。

方 法

1.实验动物及分组

第一部分实验：SPF级健康雄性SD 大鼠 30只[购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物中心许可证号： SCXK（湘）2013-0004]，体重200±20 g，所有实验动物符合动物伦理，按随机数字法随机均分成正常对照组、溶剂组(VEH, Vhicle)、Cel 0.25 mg/kg组、Cel 0.5 mg/kg组和Cel 1mg/kg组（分别用64% 、61% DMSO、50% DMSO助溶），每组大鼠于CFA造模后1、3、7、10、14 d进行热辐射阈值测定及足趾肿胀度测定，据测定结果筛选出最佳Cel浓度。

第二部分实验：在第一部分实验结果的基础上108只雄性SD大鼠随机分为正常对照组、溶剂组(VEH)和Cel 1 mg/kg组，造模后的第1、3、7、14 d每组各取12只取材处理。

2.慢性炎症痛模型制备

大鼠乙醚吸入麻醉后酒精棉球消毒左后足底皮肤，模型组及Cel 1 mg/kg组用1 ml注射器左足底皮下注射0.1 ml CFA。正常对照组左后足底注射与CFA同体积的生理盐水。造模后10 h正常对照组、VEH组及Cel 1 mg/kg组分别给予0.1 ml/100 g生理盐水、二甲基亚砜(DMSO) 及Cel腹腔注射给药，每天给药一次，持续给药14 d。

3.辐射热诱发痛的撤足潜伏期(paw withdrawal latency, PWL) 测定

实验环境要求的温度为24±1℃，湿度为55%～65%。事先调节光照强度，设定最长热辐射时间为20 s，以免灼伤大鼠足底皮肤。行为测试前，将大鼠置于薄玻璃板上，盖以透明的有机玻璃罩。大鼠适应环境15 min安静后，利用PL-200热刺痛仪（成都泰盟软件有限公司）照射大鼠后肢足底正中间，仪器自动记录从开始照射到抬足之间的时间，即为此足的缩足潜伏期。读数精确到0.01 s，每只脚重复3次，每次间隔5 min，取平均值。

4.后足容积测定

实验前用记号笔绕鼠踝关节一圈做好标记，用大鼠固定器固定好大鼠，暴露出双后肢，用足趾容积测量仪（PV-200成都泰盟软件有限公司）测量后足容积，将测量烧杯装满130 ml左右清水，放在工作面上。开始测量前先对系统进行清零，完成清零后将待测鼠的后足浸入测量烧杯的清水中至标记处，待提示“按脚踏开关确认数据”时，即可立即踩脚踏开关，此时便得到测量数据。

5.Western blot方法检测HMGB1、NF-κB及COX-2蛋白的表达

将手术侧大鼠脊髓加裂解液于匀浆器中进行冰上匀浆，12 000 r/min，5 min，4 ℃离心，BCA法行蛋白定量，取40 μg总蛋白加入上样缓冲液煮沸变性，经10% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后电转移至PVDFA膜，5%脱脂奶粉封闭1 h后，一抗4℃过夜，二抗室温孵育1 h，增强化学发光试剂孵育1 min后，进行超高灵敏度化学成像发光仪照相，用Image Lab 3.0软件测定灰度值，与其相应β-actin比较后，将对照组值定为1，计算其余组相对值。

6.q-PCR 法 检 测 HMGB1、GFAP、IL-1β 及TNF-α的mRNA的表达

采用A SYBR Select Master Mix试剂盒步骤提取总RNA并配制20 μl逆转录体系合成cDNA。反转录循环：65℃，5 min；37℃，2 min；37℃，10 min；5个循环，70℃，15 min。PCR反应引物序列由上海生工生物工程公司合成。HMGB1,Forward GAACAACACTGCTGCGGATG, Reverse CCCTTTTTCGCTGCATCAGG.GFAP, Forward-ACCTCACAGACGTTGCTTCC, ReverseGCCTCTCCAAGGACTCGTTC.IL-1β, ForwardGGGATGATGACGACCTGCTA, ReverseCCACTTGTTGGCTTATGTTCTG.TNF-α, ForwardAGAACTCCAGGCGGTGTCT,ReverseGAGCCCATTTGGGAACTTCT.GAPDH, ForwardCAGCCGCATCTTCTTGTGC,ReverseGGTAACCAGGCGTCCGATA。采用qPCR法进行扩增，PCR 扩增反应条件：预变性(95℃，10 min)；40 个扩增循环(95℃，10 s；61℃，20 s；72℃，25 s)；溶解(72℃ -95℃，0.5℃，10 s/次 )。每组重复检测3次。采用2^-ΔΔCt法分析HMGB1、IL-1β、TNF-α及GFAP的mRNA表达水平。

7.统计学方法

以Prism 5.0 软件对数据进行统计学分析；计量资料以均数 ± 标准差(±SD)表示。结果数据采用two-way ANOVA和Bonferroni' s post hoc 检验，重测资料的分析采用重复测量资料的方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.Cel对慢性炎症痛大鼠PWL、足趾肿胀度的影响

造模后VEH组及Cel组与正常对照组相比PWL均明显降低(P＜0.05)，给予Cel治疗后，观察到Cel 1 mg/kg在治疗后1、3、7、10、14 d能明显提高上述模型大鼠造模侧后足PWL值(P＜0.001)，并且明显减轻大鼠造模侧足肿胀度(P＜0.001、P＜0.01、P＜0.05、P＜0.05、P＜0.01，见图 1、2)。

2.Cel对慢性炎症痛大鼠HMGB1、COX-2蛋白表达及NF-κB的磷酸化水平的影响

与正常对照组比较，在造模后第3 d VEH组造模侧脊髓背角中HMGB1、COX-2蛋白表达明显增多及NF-κB的磷酸化水平增高，并持续增高至第14 d；与VEH组相比，Cel 1 mg/kg组造模侧脊髓背角中HMGB1、COX-2蛋白表达明显减少及NF-κB的磷酸化水平降低（P＜0.05，见图3～5）。

3.Cel对慢性炎症痛大鼠HMGB1、GFAP、IL-1β及TNF-α的mRNA的影响

与Ctrl比较，在造模后第3 d VEH组造模侧脊 髓 背 角中 HMGB1、IL-1β、TNF-α及 GFAP的mRNA表达明显增多，并持续增高至第14 d；与VEH组相比，Cel 1 mg/kg组造模侧脊髓背角中HMGB1、IL-1β、TNF-α及GFAP的 mRNA表达明显减少（见图6）。

讨 论

雷公藤红素药理活性广泛[8]，研究表明，在多种动物模型雷公藤红素表现出强大的抗炎活性，其中包括类风湿性关节炎[9]、慢性退行性疾病[10]等。在本研究中发现CFA诱导慢性炎症痛通过激活HMGB1/ NF-κB 信号通路，上调脊髓中HMGB1、NF-κB的表达。Cel 1mg/kg能明显提高慢性炎症痛大鼠的撤足阈值，明显缓解局部炎症，显著减轻患足肿胀度，并且抑制HMGB1/NF-κB通路，减少促炎介质，如IL-1β、TNF-α、COX-2的表达。

图1 Cel对慢性炎症痛大鼠PWL的影响(n=6,±SD)***P＜0.001，与Ctrl组相比 ；#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001，与 VEH 组相比Fig.1 Effect of Cel on paw withdrawal latency(PWL)in rats with chronic inflammatory pain(n=6,±SD)***P＜0.001, compared with Ctrl group; #P＜0.05,##P＜0.01 , ###P＜0.001, compared with group VEH.

图2 Cel对慢性炎症痛大鼠ΔEdema的影响(n=6,±SD)#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001，与 VEH 组相比Fig.2 Effect of Cel on foot swelling(ΔEdema) in rats with chronic inflammatory pain(n=6,±SD)#P＜0.05, ##P＜0.01, ###P＜0.001, compared with group VEH.

图3 Western blots检测各组大鼠造模侧脊髓背角HMGB1的表达(n=8,±SD)A：Western blots检测各组HMGB1的表达B：Western blots结果直方图分析*P＜0.05，***P＜0.001，VEH 组第 1，3，7，14 d分别与Ctrl组1，3，7，14 d相比；#P＜0.05，##P＜0.01，Cel组第 1，3，7，14 d 分别与 VEH组1，3，7，14 d相比Fig.3 Western blots showing expression of HMGB1 in the rat dorsal horn(n=8,±SD)A: Western blots showing expression of HMGB1 in each group.B: Quantification of Western blot data.*P＜0.05, ***P＜0.001, the 1, 3, 7, 14 d of VEH group were respectively compared with Ctrl group;#P＜0.05, ##P＜0.01, the 1, 3, 7, 14 d of Cel group were respectively compared with group VEH.

图4 Western blots检测各组大鼠造模侧脊髓背角NF-κB的磷酸化情况(n=9,±SD)A：Western blots检测各组NF-κB的磷酸化情况B：Western blots结果直方图分析*P＜0.05，VEH组第1，3，7，14 d分别与Ctrl组1，3，7，14 d 相比；#P＜0.05，##P＜0.01，Cel组第 1，3，7，14 d分别与VEH组1，3，7，14 d相比Fig.4 Western blots showing the phosphorylation level of NF-κB in the rat dorsal horn(n=9,±SD)A: Western blots showed the phosphorylation level of NF-κB in each group.B: Quantification of Western blot data.*P＜0.05, the 1, 3, 7, 14 d of VEH group were respectively compared with Ctrl group; #P＜0.05,##P＜0.01, the 1, 3, 7, 14 d of Cel group were respectively compared with group VEH.

图5 Western blots检测各组大鼠造模侧脊髓背角COX-2的表达(n=7,±SD)A：Western blots检测各组COX-2的表达B：Western blots结果直方图分析*P＜0.05，**P＜0.01，VEH 组 第 1，3，7，14 d分 别 与 Ctrl组 1，3，7，14 d相 比；#P＜0.05，###P＜0.001，Cel组第 1，3，7，14 d 分别与 VEH组1，3，7，14 d相比Fig .5 Western blots showed the expression of COX-2 in rat dorsal horn in every group at different time(n=7,±SD)A: Western blots showed the expression of COX-2 in each group.B: Quantification of Western blot data.*P＜0.05, **P＜0.01, the 1, 3, 7, 14 d of VEH group were respectively compared with Ctrl group; #P＜0.05,###P＜0.001, the 1, 3, 7, 14 d of Cel group were respectively compared with group VEH.

慢性炎症痛的发病机制复杂，当外周组织发生炎症或损伤时，为应对损伤，机体启动外周、中枢固有免疫应答，同时当外周慢性疼痛发生时，脊髓作为疼痛传递的中转站，为应对损伤将发生一系列病理生理变化，其中包括胶质细胞（如星形胶质细胞、小胶质细胞、巨噬细胞、白细胞）增生及局部促炎因子的产生，促炎因子对胶质细胞进行激活[11～13]。激活的胶质细胞将产生更多的伤害感受介质，如ATP、细胞因子及趋化因子，这些胶质递质将对神经元进行敏化，促进中枢敏化的发生[14]。促炎细胞因子，诸如IL-1β、TNF-α，参与神经炎症的发生和发展，神经炎症对慢性疼痛的启动和维持起着至关重要的作用[15]。

图6 qPCR检测各组大鼠造模侧脊髓背角HMGB1 、IL-1β、TNF-α及GFAP mRNA的表达(n=4,±SD)*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，VEH 组第 1，3，7，14 d 分别与 Ctrl组 1，3，7，14 d 相比；#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001，Cel组第 1，3，7，14d分别与VEH组1，3，7，14 d相比Fig.6 qPCR showing expression of HMGB1、IL-1β、TNF-α and GFAP mRNA in rat dorsal horn(n=4,±SD)*P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001, the 1, 3, 7, 14 d of VEH group were respectively compared with Ctrl group;#P＜0.05, ##P＜0.01, ###P＜0.001, the 1, 3, 7, 14 d of Cel group were respectively compared with group VEH.

在细胞损伤或坏死时，高迁移率族蛋白1(HMGB1)能从细胞被动分泌，也可由单核/巨噬细胞等固有免疫细胞在致炎细胞因子刺激下被动分泌[11]。研究证实，在慢性疼痛模型中，脊髓中HMGB1被激活，通过与NF-κB相互作用，从而促发下游一系列促炎细胞因子的释放，同时释放的细胞因子反过来又促进HMGB1的释放，从而形成HMGB1与炎症因子之间的正反馈循环轴，调节脊髓兴奋性突触传递及疼痛应答，参与慢性炎症痛的发生与发展[16～19]。本研究发现，对照组HMGB1、NF-κB表达水平低，VEH组HMGB1至造模后第3 d表达明显升高并维持至整个实验过程，与文献报道一致。但经Cel治疗后，脊髓HMGB1、NF-κB蛋白的表达水平明显下调，与此同时，脊髓IL-1β、TNF-α、COX-2、GFAP有一致的变化趋势，提示在CFA造模大鼠脊髓背角，HMGB1被激活，通过与NF-κB相互作用，从而促发下游一系列促炎细胞因子的释放，同时释放的细胞因子反过来又促进HMGB1的释放，可能是慢性炎症痛的机制之一

综上所述，本研究初步探究了Cel治疗慢性炎症痛的可能分子机制，预示HMGB1/ NF-κB可能为其治疗靶点之一。推测Cel通过抑制星形胶质细胞的激活，抑制HMGB1/ NF-κB信号通路从而抑制神经炎症为其治疗慢性炎症痛的机制之一，但本实验未进行造模大鼠鞘内给予HMGB1激动剂，对其更深入的镇痛机制还有待于进一步研究。