幼犬脑组织Doublecortin的表达观测

李明，武志兵，杨永强，王文成，侯燕红，刘学敏

长治医学院人体解剖学教研室，山西长治 046000

早期的神经科学研究认为，哺乳动物自出生后中枢神经系统的结构非常稳定，神经系统的发育已处于完成状态，不存在神经发育和神经再生的现象[1]。然而随着神经科学研究技术和手段的不断更新进步，科学家在对3H-thymidine和BrdU的应用研究中发现哺乳动物在出生后在其脑组织的一些部位仍然存在着活跃的神经发育和神经再生现象，这些部位集中位于海马、齿状回、室管膜下区和脑皮层这些部位，在这些部位陆续发现了新生的未成熟的神经元[2]。DCX（doublecortin）是近些年来发现的一种与神经发育和神经元迁移有关的微管相关蛋白，在哺乳动物的胚胎脑神经发育和出生后神经发育过程中，该蛋白对于不成熟神经元的定向迁移具有重要的作用[3]，DCX的表达具有一定的特异性，表达于处于发育阶段的未成熟神经元，尤其在处于迁移状态的未成熟神经元表达明显，但随着未成熟神经细胞的不断分化成熟，DCX的表达呈下调趋势。所以DCX作为检测未成熟神经元的重要标记物，在神经发育和神经再生的研究中具有较强的特异性研究价值[4]。该研究于2016年7—2017年4月选取出生后15 d幼犬4只作为研究对象，观察了DCX在哺乳动物出生后早期脑组织的表达分布情况，旨在探讨哺乳动物出生后早期神经发育的机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物处理

选取出生后15 d的普通哺乳动物家犬4只为实验对象，实验动物由本院实验动物中心提供。实验动物中心怀孕母犬室温饲养，分娩后的幼犬给予母乳加正常饮食15 d，选取健康幼犬4只，腹腔注射麻醉剂水合氯醛（0.4 mL/100 g）实施动物麻醉，动物麻醉好后迅速解剖开胸腔，左心室穿刺插管至升主动脉，开放点滴灌注生理盐水1 000～1500 mL，后灌注4%的多聚甲醛700 mL，取脑后放置于多聚甲醛溶液固定2 d，将后固定好的犬脑在15%～30%的蔗糖溶液中梯度脱水。用包埋剂将脱水后的脑组织包埋后置于低温冰箱保存8 h。把冷冻好的犬脑冠状位冰冻切片，切片厚度为15 μm，将组织切片置于抗冻液中低温冰箱保存待用。

1.2 免疫组织化学染色

主要实验试剂仪器：DCX抗体（羊抗，ab113435，Sigma公司），生物素化二抗 （ab6785，Sigm公司），ABC 试剂（PK-4000，Vector公司），显色剂 DAB（二氨基联苯胺，Vector公司），无水乙醇和H2O2（154525,161874，湖南师范大学试剂厂），多聚甲醛和二甲苯（152346,165224，上海国药集团），冰冻切片机（LEICA，德国），光学显微镜（Olymbus E53，日本）。

实验方法：取出已保存的冰冻切片室温下静置1 h，选取带有齿状回切片3～5片，于PBS缓冲液中充分漂洗3次，10 min/次，后把切片放入含1%H2O2的PBS溶液中处理30 min，然后再次洗片3次。接着再将切片放入含有5%的马血清PBS溶液中室温孵育1 h；添加 DCX 抗体（羊抗，浓度 1：1 000）室温 1 h，然后4℃冰箱过夜。第2日取出反应盒室温静置1～2 h，漂洗切片3次后，添加生物素化二抗（浓度1：400）室温孵育2 h；切片充分漂洗3次后加ABC试剂室温孵育2 h，再次充分洗片后，添加含有显色增强剂的0.05%DAB显色剂显色；在显微镜下控制严格显色时间，显色符合要求后加PBS终止显色；充分漂洗后明胶玻片贴片，乙醇浓度梯度脱水，二甲苯透明，中性树脂封片，待镜检。

1.3 显微镜下检测计数及图像处理

光学纤维镜下分别对幼犬脑组织脑皮层、白质、室管膜下区、海马和齿状回进行观测，观察DCX在各观测区的分布表达情况，同时使用图像采集系统采集图像；10×20倍光镜下观测计数各观测点的阳性细胞表达数及细胞形态，每个观测区选取6个视野观测计数；采集的图片使用软件Photoshop 9.0进行处理。

1.4 统计方法

采用SPSS 21.0统计学软件分析数据，观测数据以均数±标准差（±s）表示，进行t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 微管相关蛋白在脑各观测区的表达情况

脑皮层的表达分布情况：在脑皮层中除I层外，均有DCX阳性表达，细胞形态呈典型神经元形态，细胞突较长且染色明显，突起伸展方向基本一致，与脑皮层垂直。脑皮层I层未能观测到阳性表达，II表达明显，围绕皮层呈现连续线状分布状态，细胞突起较长，可见部分突起伸展至I层内（图1中A和B，图中箭头指示神经元长的突起）。II层下阳性细胞散在分布，不及II层内的细胞分布规律，突起伸展方向亦与脑表面垂直；室管膜下区的表达分布情况：室管膜下区为神经生发区，围绕着室管膜观测到DCX的强阳性表达，越靠近室管膜阳性细胞表达越密集分布，近室管膜处细胞突起相对较短，但相互交错分布，深层阳性表达细胞相对稀疏，但神经元突起较长，朝向基本一致，成簇状分布。近室管膜区白质中可观测到成簇分布的阳性细胞群，群中的未成熟神经元突起方向基本一致，形成神经迁移流，（图1中C和E，箭头指示为成簇分布的迁移神经元群）；海马表达情况：在海马区阳性细胞较少，表达相对较弱，阳性细胞呈现线状分布，突起明显染色且长轴与海马细胞层相垂直，海马区的未成熟神经元源自齿状回神经生发区，通过迁移最终定位于海马细胞层 （图1中D）；白质表达情况：在白质中靠近室管膜下区有成簇分布的阳性细胞表达，越靠近脑皮层，阳性细胞表达呈现下降趋势，成簇的阳性细胞形成神经元迁移流，新生神经元不断离开迁移流在白质中迁移分化，最终定位成熟于皮层（图1中C和E）；齿状回表达情况：齿状回颗粒下层观测到浓染的阳性细胞表达，阳性细胞密度较大，呈线状分布，为神经生发区之一。阳性细胞体整齐排列，相互间距离较小，一侧细胞突起较长且朝向一致，呈发射状伸入颗粒细胞层（图1中F）。

图1 DCX在幼犬脑各区的表达（A和B：DCX在脑皮层的表达；C和E：DCX在室管膜下区及白质的表达；D和F：DCX分别在海马和齿状回的表达。CS：脑沟 SR：室管膜下区 LV：侧脑室 SGZ：齿状回颗粒下层）

2.2 各观测区阳性细胞计数结果

室管膜下区阳性细胞表达最高，与脑皮层、白质和海马差异有统计学意义（P＜0.05），齿状回颗粒下层阳性细胞表达较高，与皮层、白质和海马差异有统计学意义（P＜0.05）。 见表1。

表1 阳性细胞在各观测区比较（±s）

表1 阳性细胞在各观测区比较（±s）

注：与齿状回比较，aP＞0.05，bP＜0.05；与室管膜下区比较，bP＜0.05。

观测区阳性细胞计数齿状回颗粒下层室管膜下区脑皮层脑白质海马2 9.7 0±2.1 4（2 7.3 0±2.4 1）a（1 2.0 0±1.3 2）b（1 8.5 0±1.8 8）b（6.8 3±1.1 8）b

3 讨论

该实验以幼犬作为实验研究对象，重点观测了室管膜下区、脑皮层、海马、齿状回等部位的DCX表达分布情况，其中室管膜下区和齿状回DCX表达最高[室管膜下区阳性细胞：（27.30±2.41），齿状回阳性细胞：（29.70±2.14）]， 室管膜侧壁下层观测到密集的阳性表达，细胞突起不明显，在室管膜下区白质中观测到神经细胞密集分布的神经迁移流 [阳性细胞：（18.50±1.88）]，新生神经元前导突起伸展方向基本一致，朝向白质。齿状回观测到浓染的新生神经元，一侧神经元突起明显，伸入分子层。说明哺乳动物在出生后早期其脑内仍有活跃的神经发育现象存在，神经生发区位于室管膜下区和齿状回，哺乳动物的神经发育在胚胎时期仍未完成，出生后神经发育处于持续状态。与其他学者在对成年大鼠的神经元前体细胞研究结果比较[5]，该研究发现大鼠神经前体细胞标记物DCX主要分布在室管膜下区、齿状回颗粒下层、吻侧迁移流和嗅球，其中室管膜下区DCX阳性细胞密度最高[阳性细胞：（20.45±3.74）]，在吻侧迁移流中阳性细胞[阳性细胞：（15.47±3.64）]排列有序，神经细胞前导突起方向基本一致，在齿状回颗粒下层中阳性细胞[阳性细胞：（18.83±4.35）]表达与室管膜下区表达相近，未成熟神经元前导突起单侧一致朝向分子层，嗅球中观测到大量的新生神经元 [阳性细胞：（19.79±7.24）]离开神经迁移流，向嗅球皮层迁移。该实验研究未观测嗅球的表达情况，其余观测区结果与成年大鼠观测区观测结果比较，幼犬观测区阳性细胞数量略偏高，是由于本实验使用的动物为出生后早期的哺乳动物，出生后早期神经发育处于较为旺盛的阶段，而上述学者采用的实验动物为成年大鼠，成年大鼠的神经再生在成年阶段神经发育处于完结状态，即为成年“保持”状态，但就神经再生的生发区而言，成年大鼠和幼犬的室管膜下区和齿状回都保持有旺盛的神经再生功能，大鼠脑组织神经发育研究结果与该实验研究结果基本一致。成年大鼠的研究中未提及脑皮层II中有阳性细胞表达，是由于成年大鼠脑皮层II中不存在未成熟神经细胞，该结果的差异是由于实验动物的种属选择不同造成的。该实验研究中实验动物为幼犬，在其脑皮层II层中明确观测到呈线状排列的未成熟神经元[阳性细胞：（12.00±1.32）]，神经细胞突起明显并伸展至皮层I层，有的学者认为该部位也是神经生发区之一，但该区是否是神经生发区诸多学者间仍存在分歧[6]。所以幼犬完全可作为神经发育研究的实验动物的理想选择。

近数十年的研究表明哺乳动物在出生后其脑内存在着一些区域，这些区域仍然存在着较为旺盛的神经生发功能，随着年龄的增长该功能呈现下调趋势[7]。哺乳动物在生活期间受到外界刺激或脑组织受到外伤后，这些区域的功能将会再次被激活上调，表现为神经再生功能，该功能是哺乳动物神经系统的功能储备[8]。这些特定的脑功能区集中于室管膜下区（SVZ）和齿状回颗粒下层（SGZ），实验表明这些区域终身存在具有增殖功能的神经前体细胞。其中室管膜下区存在有大量的神经前体细胞，是重要的神经生发区之一，该区域产生的未成熟神经细胞群形成吻侧迁移流（RMS）在迁移的过程中不断分化，迁移至哺乳动物嗅球，然后离开迁移流再迁移至嗅球皮层，分化成为中间神经元[9]。杨树旭等[10]学者在研究脑出血对DCX表达影响的研究中观测到：基底节脑出血动物模型中，与对照侧比较，DCX阳性细胞首先表达于室管膜下区，并且靠近出血侧神经干细胞增殖明显，反而在神经生发区齿状回未检测到新生神经元的增加，这说明脑损伤诱发的脑神经再生的分子机制还不为人所知。

对鼠类的幼年期和成年期的神经发育研究中发现出生后幼鼠脑组织内仍然存在有大量的新生神经元，说明哺乳动物出生后早期脑内仍然存在有神经生发区，不断产生的新生神经元随神经迁移流不断迁移，最终定位于脑组织不同部位完成神经发育。成年后鼠脑内的特定部位依然存在有神经生发区，虽然与幼鼠相比该功能有所下调，但受到外界刺激或脑损伤后，该功能将会被再次激活上调，不断生成新的神经元。周艳玲等人[11]通过对大鼠实施慢性复合应激后发现实验动物的海马齿状回新生神经元增多，动物的学习记忆能力明显增强，说明外界刺激可上调海马的神经功能。Aevidsson A等人[12]通过对脑损伤的研究认为：脑损伤可诱发脑内神经生发区神经前体细胞增加，但新生神经元通过定向迁移至脑损伤区，与周围神经元形成突触并完成构建完整的神经元回路，是实现神经功能修复的重要过程，但研究发现绝大多数的新生神经元未能完成上述过程而陆续死亡，仅仅有0.2%新生神经元存活，并替代受损区神经元发挥正常功能，了解掌握其中的神经再生机制并进行人为干预，对于治疗脑损伤具有非常重要的意义。

Doublecortin（DCX）是近年来发现的一种在神经发育中起调节作用特异性微管相关蛋白，参与了神经元骨架的构成，该蛋白位于神经前体细胞中，同时在处于迁移状态的未成熟神经元中位于胞体和前导突起中，在新生神经元前导突起中微管蛋白通过改变自身结构，可使神经元以伸展和回缩两种交替形式发生迁移[13]，对于神经元的定向移动迁移具有重要作用，保证了神经元迁移的稳定性。Doublecortin在中枢神经系统中已被大量发现，实验发现鼠脑中从胚龄11 d至出生后早期均有不同程度的DCX表达，胚胎脑组织中发现未成熟神经元从开始迁移直至迁移完成的整个过程中都有DCX表达。所以DCX可作为新生神经元的特异性标记物，对于研究神经发育和神经元的定向迁移有很重要的研究意义。