疏血通注射液体外抗栓及抗凝作用研究

陈艳明 ，夏 珂 ，何 杨 ，赵赟霄 ，张忠兵 ，江 淼 *，郑顺亮 ，王思瑶 ，周剑波 ，白 芳

疏血通注射液（以下简称疏血通）是由水蛭和地龙的提取物精制而成的中药注射制剂。疏血通注射液在临床心、脑血管血栓性疾病治疗中具有较好的抗凝、溶栓功效［1-3］，但其具体的分子生物学机制尚未完全明了。本研究观察疏血通作用下正常人外周血中与凝血、纤溶及血小板功能相关的指标变化，判断其主要作用方向，探讨疏血通注射液可能的抗凝、溶栓机制，并估算其有效作用浓度。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2015年5—7月，收集来自江苏省血液研究所的6例健康献血者的外周血，中位年龄37岁，男女各半。健康献血者血常规指标、凝血指标、纤溶指标、血小板功能检测以及体外血栓形成检测均在参考范围内。

1.2 药品 疏血通购自牡丹江友搏药业股份有限公司，制剂形式：干粉。

1.3 仪器及试剂 全自动血凝仪（法国Stago公司）；全自动五分类血球计数仪（日本SYSMEX公司）；血小板聚集仪（美国Chrono-log公司）；血栓弹力仪（日本Hitachi公司）；流式细胞仪（法国Beckman公司）；B104-S分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；凝血检测试剂（法国Stago公司）；血球计数试剂（日本SYSMEX公司）；组织纤溶酶原激活物（t-PA）测定ELISA试剂盒（英国Abcam公司）；纤溶酶原激活物抑制剂1（PAI-1）测定ELISA试剂盒（英国Abcam公司）。

1.4 实验方法 采用同一健康献血者的血液或血浆，以疏血通1份+血液或血浆9份（疏血通终浓度为20 μg/μl）作为加药组，0.9%氯化钠溶液1份+血液或血浆9份作为对照组。检测两组血常规指标、凝血指标、纤溶指标、血小板功能、体外血栓形成情况。

1.4.1 血常规指标检测 EDTA抗凝全血，在Sysmax全自动血常规仪上检测白细胞计数（WBC）、红细胞计数（RBC）、血小板计数（PLT）、红细胞比容（HCT）。

1.4.2 凝血指标检测 （1）枸橼酸钠抗凝全血，混匀后室温孵育15 min，随后在全自动血凝仪上检测活化部分凝血活酶时间（APTT）、凝血酶原时间（PT）、凝血酶时间（TT）。（2）血块退缩试验：EDTA抗凝全血混匀后以200×g离心5 min分离出富血小板血浆（PRP），取PRP 0.6 ml加入10 ml玻璃试管中，37 ℃温育3 min后加入0.05 mol/L CaCl2溶液，37 ℃温育2 h后弃去血凝块，计算血块收缩率。血块收缩率（%）=剩余血清体积/PRP体积×100%。（3）纠正试验：枸橼酸钠抗凝全血，两组血浆1∶1混合后在全自动血凝仪上检测APTT、PT、TT。

1.4.3 纤溶指标检测 （1）枸橼酸钠抗凝全血混匀后室温孵育15 min，随后在全自动血凝仪上检测D-二聚体、纤维蛋白原（FIB）。（2）优球蛋白溶解时间（ELT）测定：枸橼酸钠抗凝全血混匀后以1 600×g离心10 min，分离出乏血小板血浆（PPP），测定ELT。（3）t-PA测定：EDTA抗凝全血充分混匀后以1 600×g离心10 min分离出PPP后，用0.9%氯化钠溶液以1∶10稀释，采用ELISA试剂盒检测t-PA。（4）PAI-1测定：血浆及分离同（3），用0.9%氯化钠溶液以1∶80倍稀释，采用ELISA试剂盒检测PAI-1。

1.4.4 血小板功能检测 （1）血小板聚集试验：枸橼酸钠抗凝全血充分混匀后以200×g离心5 min分离出PRP，剩余样品以1 600×g离心10 min分离出PPP，在血小板聚集仪上以光学比浊法分别检测4种诱导剂〔二磷酸腺苷（ADP）、瑞斯托霉素、胶原、凝血酶〕诱导的血小板聚集率。（2）血小板黏附试验：枸橼酸钠抗凝全血，分别加入疏血通或者 0.9%氯化钠溶液，37 ℃温育15 min后加入50 μl钙黄绿素溶液，37 ℃再温育15 min。将上述血液以1 500 r/s的恒定剪切力流过事先包被胶原蛋白的玻璃平板（包被方法：人胎盘Ⅲ型胶原在pH值为3.0的醋酸溶液中溶解后以PBS溶液调整浓度至50 μg/ml，取200 μl涂布于载玻片中央，4 ℃静置过夜），血液流尽后以0.9%氯化钠溶液轻轻漂洗玻璃平板，将平板置于20倍荧光纤维镜下计算血小板黏附率。（3）P-选择素测定：枸橼酸钠抗凝全血充分混匀后室温静置15 min，取全血10 μl加入PE标记的抗P-选择素抗体2 μl，37 ℃温育15 min后加0.9%氯化钠溶液0.5 ml，在流式细胞仪上检测P-选择素。

1.4.5 体外血栓形成检测 枸橼酸钠抗凝全血，充分混匀后室温孵育15 min，随后在血栓弹力仪上检测体外血栓形成情况，检测R值、K值、α角、MA值。

1.5 统计学方法 应用SPSS 20.0统计软件进行统计学分析。计量资料以（s）表示，两组间比较采用配对t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血常规指标 对照组WBC、PLT高于加药组，差异有统计学意义（P＜0.05）。两组RBC、HCT比较，差异无统计学意义（P＞0.05，见表1）。

2.2 凝血指标 对照组APTT、PT、TT、血块收缩率分别为（37.7±3.9）s、（12.7±0.4）s、（17.2±0.9）s、（55.8±8.0）%，加药组APTT、PT、TT、血块收缩率分别为（46.8±5.7）s、（16.6±0.5）s、（34.9±2.0）s、（55.6±6.8）%，纠正试验的APTT、PT、TT分别为（41.3±4.2）s、（14.0±0.5）s、（23.5±0.8）s。加药组APTT、PT、TT长于对照组，差异有统计学意义（t配对=4.916、10.405、10.571，P值均＜0.001）；对照组与加药组血块收缩率比较，差异无统计学意义（t配对=0.133，P=0.897）。纠正试验的APTT、PT、TT长于对照组，差异有统计学意义（t配对=4.499、8.614、8.085，P=0.001、＜0.001、＜0.001）；纠正试验的APTT、PT、TT短于加药组，差异有统计学意义（t配对=4.891、9.749、7.113，P值均＜0.001）。

2.3 纤溶指标 加药组D-二聚体、t-PA高于对照组，FIB、ELT、PAI-1低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05，见表2）。

2.4 血小板功能 加药组ADP、瑞斯托霉素、胶原、凝血酶诱导的血小板聚集率低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。两组血小板黏附率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。加药组P-选择素高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05，见表3）。

2.5 体外血栓形成 加药组R值、K值长于对照组，α角、MA值小于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05，见表4）。

表1 两组血常规指标比较（s，n=6）Table1 Blood routine index changes between two groups

表1 两组血常规指标比较（s，n=6）Table1 Blood routine index changes between two groups

注：WBC=白细胞计数，RBC=红细胞计数，PLT=血小板计数，HCT=红细胞比容

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表2 两组纤溶指标比较（s，n=6）Table2 Changes in fibrinolysis related indicators between two groups

表2 两组纤溶指标比较（s，n=6）Table2 Changes in fibrinolysis related indicators between two groups

注：FIB=纤维蛋白原，ELT=优球蛋白溶解时间，t-PA=组织纤溶酶原激活物，PAI-1=纤溶酶原激活物抑制剂1

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表4 两组体外血栓形成变化（s，n=6）Table4 Changes of in vitro thrombosis between two groups

表4 两组体外血栓形成变化（s，n=6）Table4 Changes of in vitro thrombosis between two groups

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表3 两组血小板功能比较（s，n=6）Table3 Changes in platelet function between two groups

表3 两组血小板功能比较（s，n=6）Table3 Changes in platelet function between two groups

注：ADP=二磷酸腺苷

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3 讨论

疏血通有效成分为水蛭和地龙提取物，水蛭的活性成分——水蛭素，是一种特效的凝血酶抑制剂［4］。地龙主要成分为蚓激酶，蚓激酶具有类组织型纤溶酶原激活物的作用［5］，两者结合具有强大的抗血栓形成和纤溶活性作用。疏血通有抗凝、抗栓、促纤溶等作用，但利用人血液进行系统的体外抗凝、抗栓、促纤溶研究较少。

本研究结果显示，对照组WBC、PLT高于加药组，可能是疏血通引起血小板之间或者血小板-白细胞聚集，这样的细胞比白细胞大，血球计数仪不能识别这样的聚集细胞导致仪器读数下降，无临床意义。加药组APTT、PT、TT长于对照组，提示该药对内源性凝血途径和外源性凝血途径均有影响，与黄越冬等［6］的研究结果一致，有利于延缓血栓的形成。加药组D-二聚体、t-PA高于对照组，FIB、ELT、PAI-1低于对照组，这些纤溶指标的变化提示加入疏血通后，血液中纤溶活性增强，且促进了血栓溶解。

疏血通在较高浓度下对多种诱导物引起的血小板聚集以及血小板黏附均有抑制作用，提示药物中的某些成分可能影响了血小板聚集的共同通路。血小板的磷脂表面以及血小板膜糖蛋白ⅡbⅢa、糖蛋白Ⅰb等均可能是作用靶点。血块收缩率无明显变化，提示与血小板骨架相关的黏附分子不受影响。

本研究结果显示，加药组ADP、瑞斯托霉素、胶原、凝血酶诱导的血小板聚集率低于对照组，P-选择素高于对照组，提示疏血通能明显促进血小板表面P-选择素的表达，药物中的水蛭素可能是产生这一效应的原因。最新的研究认为，血小板表面P-选择素的表达增加可以促进白细胞向血栓形成部位迁移、积聚，并最终与血小板、纤维蛋白原等交联形成复合血栓，这种类型的血栓比纯血小板血栓相对疏松，更易于被u-PA等纤溶促进物降解，这一机制有利于机体控制血管内血栓的过度生长，并且能降低缺血再灌注损伤，这或许能为临床上疏血通对脑卒中患者脑神经的保护提供一些理论线索［7］。

在本实验中疏血通起作用的有效浓度约为20 μg/μl，该浓度与药品提供方之前在大鼠等动物中进行的体内试验有效浓度相当，当浓度低于10 μg/μl时大多数前述有变化的指标与对照相比不再有意义［8］。在人体内用药，或许需要一定的用药时间的累积才能达到有效浓度，因此对该药在体内的药效学与药动学之间的关系有必要做更多的研究。另一方面，通过对该药中有效成分的进一步提取，有可能明显降低给药量。

综上所述，疏血通可多方向、多靶点发挥抗凝、抗栓、促纤溶等作用。由于本文作者是在抗凝、抗栓、促纤溶药效层面对疏血通抗栓作用的研究，尚未深入到机制研究层面，因此研究者后续可以针对此不足研究疏血通作用于凝血瀑布的具体丝氨酸蛋白酶、血小板功能及P-选择素或PAI-1的生成或结合来阐明疏血通的抗栓作用机制。

作者贡献：夏珂、张忠兵、江淼进行研究设计与实施、资料收集整理，撰写论文并对文章负责；陈艳明、何杨、赵赟霄进行研究实施、评估、资料收集；郑顺亮、王思瑶、周剑波、白芳进行质量控制及审校。

本文无利益冲突。