线粒体途径相关信号通路对成骨细胞凋亡的作用

翁文玉 郝烨华 张瑜生 周志昆

广东医科大学药学院，广东 东莞 523808

骨质疏松(osteoporosis,OP)是老年人和绝经后女性中常发生的全身性代谢性骨病，以骨量减少、骨微结构遭到损坏，导致骨脆性增加、易发生骨折为特征[1]。随着人口老龄化的增加，OP已成为一个日趋严重的公共健康问题，给许多国家带来了沉重的经济负担[2]。截至2017年，中国60岁及以上人口达到2.41亿人，占总人口的17.3%[3]。在美国和欧洲，有30%的女性患有骨质疏松症，40%的绝经后妇女和30%的男性经历过骨质疏松性骨折[4]。因此，如何有效地预防和治疗骨质疏松已成为现代医学研究的迫切问题。

有研究表明骨量的保持不仅取决于破骨细胞的吸收功能和成骨细胞(osteoblast，OB)的成骨功能，还取决于成骨细胞和破骨细胞的产生率和凋亡率的差异[5]，成骨细胞和破骨细胞的异常凋亡被认为是骨质疏松发病的重要致病机制，其中，成骨细胞凋亡的增加和成骨细胞数量的下降被认为是引起骨量丢失的关键发病机制[5]，因此，预防成骨细胞的凋亡也将成为治疗骨质疏松的有效策略。

目前，细胞凋亡的途径主要有三条：线粒体途径、死亡受体途径和内质网途径，其中，线粒体途径是主要的凋亡途径[6]。 线粒体介导的凋亡信号通路的激活诱导OB凋亡，促进骨质疏松症的发生[7]。因此，探索OB经线粒体途径凋亡的分子机制，对于研究OP的发病机制，以及预防和治疗OP具有重要意义。近年研究表明，成骨细胞经线粒体途径凋亡的相关信号通路有：磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3- kinase，PI3k)/Akt、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、Ca2+/CaM和其他信号通路等。

本文通过综述线粒体途径相关信号通路和因子对OB凋亡的作用，来为进一步研究安全、有效的抗骨质疏松药物提供依据和新的作用靶点。

1 线粒体途径介导的成骨细胞凋亡

线粒体既是细胞生命活动的控制中心，也是细胞凋亡的中心[8]。线粒体跨膜电位 ΔΨm的下降是线粒体介导的细胞凋亡的第一步[7]。众多凋亡诱导因素导致线粒体通透性转运孔(MPT)破坏或开放，ΔΨm下降，线粒体通透性增强，促进了细胞色素C(Cyt C)和细胞凋亡诱导因子(AIF)从线粒体中释放，从而激活线粒体的半胱天冬酶(caspase)依赖性和非依赖性凋亡途径[7,9]。释放到细胞质中的Cyt C特异性地结合接头蛋白Apaf-1，同时直接募集大量caspase 9并使之活化，进而诱导caspase级联反应，激活 caspase 3，切割聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶(poly-ADP-ribose polymerase，PARP，一种DNA修复酶)，引发不可逆的caspase依赖性细胞凋亡[7]。释放到细胞质中的AIF 聚集，易位到细胞核，引起DNA断裂，从而激活了线粒体caspase非依赖性凋亡途径[9]。

在线粒体途径介导的凋亡过程中，Bcl-2 蛋白家族的活性与其密切相关。 Bcl-2蛋白家族位于线粒体外膜上，根据其功能和结构上不同分为三个亚家族：①促凋亡BH3唯一蛋白(Bad、Bid、Bik、Bim、Bmf、Hrk、NOXA、PUMA等)，②抗凋亡蛋白(Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-W、Mcl-1、BFL-1/A1)，③促凋亡效应分子(Bax、Bak、Bok)[10]。众多研究表明，线粒体内Bcl-2、Bcl-xL蛋白表达的增加会抑制成骨细胞凋亡，而Bad、Bax、Bak、Bim等蛋白表达的增加则会促进成骨细胞的凋亡[7,11-12]。Jilka等[5]敲除大鼠的Bak和Bax基因进行研究，结果显示，Bak和Bax基因缺乏的大鼠中成骨细胞凋亡的数量显著减少。

线粒体是活性氧(ROS)的重要来源，如：超氧化物(O2-)和过氧化氢(H2O2)，而过量的ROS会诱导氧化应激反应，破坏线粒体的呼吸链，引起线粒体功能障碍[13]。过量ROS可以激活Bid，改变线粒体膜通透性，促使Cyt C释放，引起细胞凋亡[14]。可见，过量ROS引起的氧化应激会引起依赖于线粒体的细胞凋亡。

2 线粒体途径相关信号通路对成骨细胞凋亡的作用

2.1 PI3k/Akt信号通路与成骨细胞凋亡

磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)是一种具有磷脂酰肌醇激酶和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶双重活性的脂类激酶，由调节性p85亚基和催化性p110亚基组成[15]。丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Akt又称为蛋白激酶B(protein kinase B,PKB)，拥有一个PH域。当生长因子和细胞因子等一系列细胞外信号与受体酪氨酸激酶(RTK)和G-蛋白偶联受体(GPCRs)结合时，酪氨酸残基发生自身磷酸化，PI3K的p85亚基进入到质膜的内表面，催化细胞膜内层的磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(PIP2)被p110亚基磷酸化，形成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸(PIP3)，PIP3分别与Akt和三磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(PDK1)的PH域结合，使 Akt的S124、T450位点磷酸化和使PDK1磷酸化，磷酸化的PDK1 和哺乳动物雷帕霉素目标复合物(mTORC2)再分别使Akt的T308、S473位点磷酸化，从而完全激活Akt[16]。激活后的Akt作用于下游因子，调节细胞生命活动。

当PI3k/Akt信号通路激活后，进而作用于线粒体途径的Bcl-2蛋白，从而主导成骨细胞经线粒体途径的凋亡。丹参素通过上调PI3k/Akt信号通路，减少了MC3T3-E1成骨细胞中促进凋亡的相关蛋白Bax、AIF、Cyt C的表达，从而抑制成骨细胞凋亡[17]。而PI3K/Akt特异性抑制剂LY294002可以下调p-Bad的表达，上调Bad的表达，进而上调了Bax/Bcl-2(促进Bax表达，抑制Bcl-2表达)和caspase-3的表达，结果表明PI3K/Akt途径的失活通过下调p-Bad来部分阻断成骨细胞中的抗凋亡作用[18]。Bin等[19]研究也表明，流体切应力抗TNF-α导致的成骨细胞凋亡，激活 PI3k/Akt 信号通路，活化的Akt使FoxO3a磷酸化，降低Bim和caspase-3的表达。综合这些研究表明，由PI3k激活的Akt，可以进一步通过抑制 Bad、Bim、Bax等促凋亡蛋白的表达，促进Bcl-2和Bcl-xL抗凋亡蛋白的表达，减少线粒体途径Cyt C、AIF、caspase-9、 caspase-3等相关促凋亡分子的表达，抑制OB经线粒体途径的凋亡。

此外，PI3k/Akt还可以与其他信号通路相互作用，可以进一步激活FoxO3a[19]、CREB[20]等多种转录因子，从而抵抗氧化应激所导致的线粒体功能障碍，抑制OB的凋亡。因此，PI3k/Akt信号通路是预防和治疗骨质疏松的关键性靶点。

2.2 MAPK信号通路与成骨细胞凋亡

丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路是由MAPK激酶激酶(MAPKKK)、MAPK激酶(MAPKK/MEK/MKK)和MAPK组成的三步连续磷酸化级联，三者又分别含有不同的亚族， MAPKKK含有Raf亚族(B-Raf、A-Raf、Raf-1)、MEKK亚族(MEKK1-4)、 ASK1和MST，MAPKK含有MEK1/2、MKK3和MKK6，MAPK含有ERK1/2、ERK5、p38、JNK等亚族[15]。四种主要的MAPKs： JNK、ERK1/2、ERK5、和p38被各种生物和物理化学应激物激活后，在应激反应中起关键作用，包括细胞增殖、分化，细胞因子产生和细胞的生存、凋亡等[21]。

2.2.1MAPK/JNK信号通路与成骨细胞凋亡：MAPK/c-Jun N末端激酶(JNK)信号通路是由ASK1、MEKK1激活MKK4/7，进而激活JNK1/2/3,活化的JNK激活下游因子，引起一系列细胞生命活动[15]。众多研究显示，当MAPK/JNK信号通路被激活时，JNK的磷酸化状态显著增加，c-Jun的mRNA和蛋白表达均显著上调，JNK进而抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，而促进促凋亡蛋白(Bax，caspase9，caspase3和相关凋亡因子配体)的增加，从而调控OB凋亡[22]。Guo等[23]研究表明，脂多糖(LPS)通过激活JNK途径，显著提高了p-JNK的蛋白水平，降低了MC3T3-E1成骨细胞中Bcl-2的表达,上调了Bax和caspase-3的mRNA的表达，激活caspase-3的活性，诱导OB经线粒体途径凋亡。JNK特异性抑制剂SP600125的预处理则可增强抗凋亡蛋白Bcl-2表达，抑制 Bax从细胞质转运到线粒体，阻断线粒体中Cyt C的释放和caspase-3的激活，抑制成骨细胞凋亡[24]。可见，MAPK/JNK信号通路促进OB经线粒体途径凋亡，而阻断该信号通路的传导可以是一种抗OB凋亡的有效手段。

2.2.2MAPK/ERK1/2信号通路与成骨细胞凋亡：MAPK/细胞外信号调节激酶(ERK)1/2信号通路由Raf同工酶B-Raf、A-Raf、Raf1激活MEK1/2，再进一步激活ERK1/2，进而作用于下游因子，调节细胞活动[15]。目前，有研究表明，MAPK/ERK1/2信号通路会抑制成骨细胞的凋亡。Chen等[25]研究表明，姜黄素通过激活ERK1/2通路，上调p-ERK1/2的表达，抑制由地塞米松(Dex)诱导的Bcl-2下调和Bax上调，从而抑制线粒体中Cyt C的释放，抑制Caspase-3的激活和其导致的PARP的裂解，最终抑制细胞凋亡，保护OB免受Dex诱导的细胞凋亡。Zhu等[26]研究也表明，Vaspin促进ERK1/2磷酸化，上调Bcl-2的表达，下调Bax的表达，降低人成骨细胞的凋亡。而另一部分研究却表明，ERK1/2信号通路会促进成骨细胞的凋亡。Nam等[27]研究表明，槲皮素通过激活ERK引起线粒体依赖性机制诱导成骨细胞凋亡,ERK1/2活化，促进Bax的表达，诱导细胞凋亡。Zhao等[28]研究也表明，镉(Cd)可以诱导OB的凋亡，通过增加 ERK1/2的磷酸化，降低线粒体跨膜电位 ΔΨm，增强 caspase-3的活性，而ERK1/2抑制剂(U0126)则消除了Cd诱导的细胞凋亡。这些研究显示，MAPK/ERK1/2信号通路参与了OB经线粒体途径的凋亡，但其对于凋亡的具体作用存在一定争议，其调控机制尚不十分明确。

2.2.3MAPK/ERK5信号通路与成骨细胞凋亡：MAPK/ 细胞外信号调节激酶5(ERK5，也称为BMK1)信号通路由MEKK2/3激活MEK5，进而激活ERK5，活化的ERK5作用下游因子，也参与了抗凋亡的途径[21]。Bin等[29]研究表明，流体剪切应力(FSS)通过激活ERK5信号通路阻断TNF-α诱导的MC3T3-E1成骨细胞凋亡，活化的ERK5可以从细胞质穿梭至细胞核，导致Bad磷酸化,p-Bad被细胞质中的14-3-3蛋白质隔离，阻止其转移至线粒体，抑制Bad，从而抑制其诱导的线粒体途径caspase-3的活化。此外，Bin等[19]研究还发现，FSS通过激活p-ERK5，进一步激活p-Akt，活化FOXO3a，从而减少Bim的表达，抗TNF导致的OB凋亡。这些结果提示ERK5信号通路在FSS介导的成骨细胞抗凋亡作用中发挥重要作用。因此，ERK5信号通路可能成为抗骨质疏松症新药的一个治疗靶点。

2.2.4MAPK/p38信号通路与成骨细胞凋亡：MAPK/p38信号通路由ASK1、TAK1激活MKK3/6，再进一步激活p38[15]。Yang等[30]研究表明，白介素(IL-1α)可以增加p38-MAPK的磷酸化，下调MC3T3-E1细胞中Bcl-2的表达，而显著上调Bax和caspase-3的mRNA表达和蛋白水平，促进OB经线粒体途径的凋亡。Guo等[31]研究表明，用槲皮素预处理下调p-p38MAPK蛋白的表达，则显著恢复了Bcl-2和Bcl-xL的下降表达，降低了Bax的表达，从而抑制了Cyt C和caspase-3的表达，抑制LPS诱导的OB经线粒体凋亡途径的凋亡。可见，这些药物或因子通过激活或抑制MAPK/p38信号通路，进而影响Bcl-2家族蛋白的活性，发挥着促进或抑制OB经线粒体途径的凋亡的作用。

2.3 Ca2+/ CaM信号通路与成骨细胞凋亡

Ca2+/ CaM信号通路的激活是由细胞外信号与受体结合，激活GPCRs，进而激活磷脂酶C(PLC)，活化的PLC使磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(PIP2)分解为DAG和三磷酸肌醇(IP3)，后者作用于内质网IP3受体，使内质网中的Ca2+释放，胞液中Ca2+浓度增加，激活钙调蛋白(CaM)形成Ca2+/CaM复合物，进而使钙调蛋白依赖性蛋白激酶(CaM-PK)磷酸化，作用于下游因子，引起生理效应。

Ha等[32]研究表明，Cd激活Ca2+/CaM信号通路，破坏细胞内Ca2+浓度的平衡，使Ca2+增加，促进Ca2+/CaM复合物的形成，Ca2+/CaM复合物激活三个效应蛋白：钙调蛋白依赖性磷酸二酯酶(CaM-PDE)、钙调蛋白依赖性激酶激酶(CAMKK)和钙调蛋白依赖性激酶II(CAMKII)。其中，活化的PDE激活ERK，诱导OB凋亡，而活化的CAMKK，则抑制ERK，抑制OB凋亡。另有研究表明，AlCl3使细胞内Ca2+增加，促进Ca2+/ CaM复合物的形成，进而使CaMKII磷酸化，活化的p-CaMKII诱导氧化应激，破坏线粒体呼吸链，引起OB凋亡[33]。可见，Ca2+/ CaM信号通路会与ERK交互作用来发挥对OB的抗凋亡或促凋亡作用。

2.4 其他信号通路和因子与成骨细胞凋亡

2.4.1Keap1/Nrf2信号通路：Keap1-Nrf2信号通路在保护细胞免受氧化应激损害方面发挥着重要作用[34]。Liu等[35]的研究表明，SFP激活Keap1-Nrf2信号通路，促进其下游因子HO1和NQO1增加，从而减弱Dex诱导的caspase活化、PARP切割，即通过调节Nrf2途径来抑制Dex诱导ROS过量产生的OB凋亡。

图1 OB经线粒体途径凋亡及其相关的各信号通路和因子的作用示意图。Fig.1 The schematic diagram of the apoptosis of OB by mitochondrial pathway and the effects of its related signaling pathways and factors

2.4.2PHB：抗增值蛋白(PHB，包括PHB1和PHB2)是位于线粒体内膜一种蛋白质，与氧化应激的产生有关，PHB 1与PHB 2的相互作用对呼吸链和线粒体膜通透性的稳定起着重要作用[36]。Sripathi等[37]研究发现，敲除PHB基因，可以上调促凋亡因子(BAK和caspases)的表达，下调抗凋亡分子Bcl-xL的表达。而PHB的过表达却会下调Bcl-2的表达，引起凋亡[38]。同时，PHB还与多条信号通路有关，如Akt2、CaMK可以激活PHB，而PHB则可以作用于PI3K/Akt、Raf/MEK/ERK信号通路、CytC和Bcl-2等[36]。此外，抗骨质疏松药物黄芪三仙汤和艾香汤剂均能引起OB中PHB表达的明显差异[39-40]。这些研究表明PHB参与了抑制或促进线粒体途径凋亡的过程，PHB可以作为研究抗骨质疏松药物的一个新靶点。

2.4.3Fox O家族：Fox O家族是一个重要的转录调节器，与多种功能细胞的关键蛋白质有关，主要包括四个成员：Fox O1、Fox O3a、Fox O4和Fox O6[41]。其中，Fox O3a与细胞凋亡密切相关，Fox O3a由Akt直接激活[41]。流体切应力抗TNF-α诱导的OB凋亡，激活PI3k/Akt信号通路，Akt1使Fox O3a磷酸化，p-Fox O3a抑制Bim的表达，减少caspase-3，从而抵御氧化应激，抗OB凋亡[19]。

2.4.4cAMP/CREB：cAMP/CREB转录因子的Ser133位点能够被Akt/PKB磷酸化，p-CREB促进Bcl-2、Mcl-1的表达[42]，抑制抗霉素A(AMA)诱导的线粒体功能障碍，从而阻止OB凋亡[20]。

3 结语

综上所述，线粒体途径相关的众多信号通路与因子对OB的凋亡发挥着促进或抑制的作用(如图1所示)。其中PI3k/Akt、MAPK/ERK5信号通路的激活，MAPK/JNK、MAPK/p38等信号通路的抑制，是抑制OB凋亡，防治骨质疏松的关键，因此，Akt、ERK、JNK、p38、Ca2+、PHB、FoxO3a、CREB、Keap1/Nrf2等因子可以作为研究抗骨质疏松药物的关键作用靶点。