仙灵骨葆胶囊对去势大鼠骨组织ERα、JMJD2B、Runx2和ALP表达的影响

郭海 王海彬 苟凌云 周驰 覃智斌 钟伟华 王粤淇 朱永林 邓章荣 朱勇 霍少川

1.柳州市中医医院创伤骨科/广西中医药大学第三附属医院，广西 柳州 545000 2.广州中医药大学岭南医学研究中心中医骨伤科学实验室，广东 广州 510405 3.广州中医药大学第一附属医院关节骨科，广东 广州 510405 4.广州中医药大学第一临床医学院，广东 广州 510405 5.桂林市中医医院，广西 桂林 541000 6.南方医科大学，广东 广州 510405

绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis，PMOP)是一种全身性骨代谢疾病，其特征在于绝经后进行性的骨量减少和骨微细结构退变[1]。女性绝经后引起的雌激素缺乏会增加骨吸收并加速骨质流失。目前临床上常用的激素替代疗法如福善美、福美加等西医药物治疗，在改善绝经后骨质疏松方面虽起到一定疗效，见效快，但副作用不能忽视。因此，寻找一种对于PMOP疗效确切、安全性高的药物是业内面临的重要挑战。中医强调“肾主骨”，“脾主肌肉”及“气血不通则痛”，骨质疏松症治疗当以补肾益精、活血祛瘀为法。仙灵骨葆胶囊含有淫羊藿、续断、丹参、知母、补骨脂等成分，是一种以中医药理论为依据制成的既能预防又能治疗的中成药，兼补肝肾、强筋骨、化瘀血之功效，在PMOP治疗中具有良好的临床疗效[2]。实验研究已证明仙灵骨葆胶囊能够提高大鼠的骨量，但其是否通过表观遗传学机制发挥作用目前并不清楚。组蛋白去甲基化酶JMJD2B表达水平与骨密度呈正相关性，可作为PMOP的一种预测指标[3]。本研究在此基础上采用去势大鼠模拟绝经后骨质疏松症，给予仙灵骨葆胶囊和福美加药物干预，观察仙灵骨葆胶囊对去势大鼠的干预疗效，探讨其防治骨质疏松的表观遗传学机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选取40只6月龄雌性SD大鼠(SPF级)，由广州中医药大学实验动物中心供应并饲养，遵循动物伦理，大鼠许可证号为：SYXK(粤)2013-0001，平均质量：(447.24±59.57) g。所有大鼠生长环境一致，湿度恒定(约50%)，室温稳定(维持23～25 ℃之间)，饲料、饮水等均统一配备，保持室内良好通风，大鼠入室1周内为适应喂养，随后建立骨质疏松模型。

1.2 实验药物

仙灵骨葆胶囊(贵州同济堂制药有限公司提供，国药准字Z20025337)。福美加(杭州默沙东制药有限公司提供，国药准字J20130085)。

1.3 主要仪器和试剂

1.3.1仪器：本实验所需仪器主要包括由Bio-Rad公司提供的荧光定量PCR仪器、电泳仪、逆转录仪、全能型凝胶成像系统；Thermo公司提供的多功能酶标仪；Eppendorf公司提供的离心机；海门市其林贝尔仪器制造有限公司提供的脱色摇床；以及灰度分析软件。

1.3.2试剂：本实验所需试剂主要包括由Genecopies公司提供的荧光定量PCR检测试剂盒，DBI公司提供的逆转录试剂盒。引物设计为：ERα：上游：5’-TGCAGGGAGAAGAGTTTGTG-3’，下游：5’-GAGACTTCAAGGTGCTGGATGA-3’；MJD2B：上游：5’-GGGAACAACCTCCTTCTCTAAG-3’，下游：5’-CTCCTGCTTGACCACAGATAG-3’；Runx2：上游：5’-CCTTGCTCTCTGTTCCTTCTC-3’，下游：5’- AGGTTGGAGGCACACATAAG -3’；ALP：上游：5’-CATGTTCCTGGGAGATGGTATG-3’，下游：5’-GTGTTGTACGTCTTGGAGAGAG-3’，由广州四和生物科技有限公司提供。

1.4 实验方法

1.4.1分组与造模：根据随机数字表法将40只SD大鼠分为4组：空白对照组、阴性对照组、实验组和阳性对照组。造模方法：根据大鼠体重以0.35 mL/100 g比例腹腔注射一定体积10%水合氯醛水溶液麻醉，空白对照组中的SD大鼠保留双侧卵巢，仅切除卵巢旁部分脂肪；另外3组SD大鼠经手术切除双侧卵巢，制备骨质疏松模型。造模后置于鼠笼中单独饲养，术后连续3 d给予青霉素钠(国号准字：H11020456)肌肉注射(5万U/d)，预防感染。饲养1周。

1.4.2药物干预：造模1周后，按照人与大鼠体表面积比折算成大鼠等效剂量，实验组按30.85 mg/100 g比例给予一定量仙灵骨葆胶囊，每天给药1次；阳性对照组按11.7 mg/100 g比例给予一定量福美加，每周给药1次；空白对照组、阴性对照组给予同体积蒸馏水，每天1次。时间均为3个月。

1.4.3指标检测：干预3个月后，处死各组大鼠，取右侧股骨置于液氮中暂时保存。PCR定量实验时，将50 mg股骨组织研成粉末状后置入EP管内，加入1 mL Trizol Reagent进行冰浴，并持续匀浆30 min，取匀浆后上清液至新EP管内，12 000 r/min转数离心，时间为15 min，取上清液备用。根据荧光定量PCR检测试剂盒说明书提取总RNA。通过RT-PCT检测ERα、JMJD2B、Runx2和ALP mRNA 表达；在装有50 mg股骨组织的EP管内加入约10倍股骨组织体积RIPA裂解液，进行匀浆处理，获取总蛋白，根据BCA蛋白定量试剂盒说明书指示，对所提取的蛋白进行定量，包括上样、电泳与转膜，孵育一抗、二抗。采用ChemiDocMP型全自动数码凝胶成像系统成像，Image J软件分析蛋白电泳条带灰度值，以β-actin作为内参照蛋白进行校准，采用目标蛋白条带灰度值/β-actin条带灰度值来表示ERα、JMJD2B相对蛋白表达水平。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 股骨组织ERα、JMJD2B表达

与空白对照组比较，实验组ERα、JMJD2B蛋白及其mRNA表达量明显下降，两组对比有统计学意义(P<0.05)。与阴性对照组比较，实验组ERα、JMJD2B蛋白及其mRNA表达量明显上升，两组对比有统计学意义(P<0.05)。与阳性对照组比较，实验组ERα、JMJD2B蛋白及其mRNA表达量明显上升，两组对比有统计学意义(P<0.05)。见表1，图1～4。

表1 各组大鼠ERα、JMJD2B表达量 Table 1 Expression of ERα and JMJD2B in each group pg / mL)

注：与空白对照组比较，*P<0.05；与阴性对照组比较，#P<0.05；与阳性对照组比较，△P<0.05。

2.2 成骨相关基因Runx2、ALP表达

与空白对照组比较，实验组Runx2、ALP表达量明显下降，两组对比有统计学意义(P<0.05)；与阴性对照组比较，实验组的Runx2、ALP表达量明显上升，两组对比有统计学意义(P<0.05)；与阳性对照组比较，实验组的Runx2表达量明显下降(P<0.05)。见表2，图5～6。

图2各组ERα mRNA表达水平Fig.2 ERα mRNA expression levels in each group

注：与空白对照组比较，*P<0.05；与阴性对照组比较，#P<0.05；与阳性对照组比较，△P<0.05。

图3 各组JMJD2B的表达水平Fig.3 JMJD2B expression levels in each group

图4 各组JMJD2B mRNA的表达水平Fig.4 JMJD2B mRNA expression levels in each group

组别Runx2ALP空白对照组1.62±0.111.57±0.37阴性对照组0.15±0.020.24±0.03实验组0.88±0.06*#△0.94±0.30*#阳性对照组1.21±0.021.01±0.18F值/P值280.553/0.00013.306/0.002

注：与空白对照组比较，*P<0.05；与阴性对照组比较，#P<0.05；与阳性对照组比较，△P<0.05。

图5 各组Runx2表达水平Fig.5 Runx2 expression levels in each group

图6各组ALP表达水平Fig.6 ALP expression levels in each group

注：与空白对照组比较，*P<0.05；与阴性对照组比较，#P<0.05；与阳性对照组比较，△P<0.05。

3 讨论

骨质疏松是由于骨量下降、骨组织微细结构遭到破坏，导致骨脆性增加、易发骨折，属全身骨代谢疾病[4]。PMOP作为骨质疏松症的常见类型，多发生于女性绝经后5～10年，在全世界范围内给大约超过50%的绝经后老年女性的生活与健康带来极大影响[5]。绝经后妇女雌激素水平迅速下降，ER相关蛋白表达水平下降，导致骨形成与骨吸收平衡失调，骨吸收程度大于骨形成，造成骨量丢失[6]，这提示ER与PMOP密切相关。研究发现[7]ER基因启动子可能通过甲基化而抑制蛋白表达，影响骨形成与成骨分化。本实验采用去势大鼠模拟绝经后妇女体内雌激素缺乏状态，从表观遗传学角度阐释仙灵骨葆胶囊防治骨质疏松可能作用途径。

组蛋白去甲基化酶JMJD2B可作为ER的共同激活因子，其表达水平受雌激素与ER调控[8]，可见，JMJD2B在骨代谢方面可能与雌激素-ER信号通路存在一定关联。本研究发现大鼠卵巢摘除后股骨组织中JMJD2B、ERα表达量明显下降。经仙灵骨葆胶囊与福美加干预，去势大鼠股骨组织JMJD2B、ERα表达水平均明显上升。与前期研究一致，仙灵骨葆胶囊能够提高JMJD2B、ERαmRNA及蛋白表达量。

王培霞等[9]研究发现，仙灵骨葆胶囊能明显提高去势小鼠骨密度，改善骨微结构，减少骨质破坏，提高骨质生物力学参数。Runx2基因表达能诱导成骨细胞增殖及分化，增强骨再生[10]。ALP由成骨细胞分泌，是成骨细胞活性的标志物[11]。两者均是骨生长的相关基因，可作为评估骨质疏松症的疗效指标。本研究结果提示仙灵骨葆胶囊与福美加均能显著提高去势大鼠股骨组织的Runx2、ALP表达水平，且仙灵骨葆胶囊较福美加提高幅度更大。

综上所述，本研究得出结论，去势大鼠股骨组织中ERα、Runx2、JMJD2B、ALP表达量降低，仙灵骨葆胶囊能提高其表达水平。