荧光染色法和KOH湿片法、真菌培养法在皮肤浅部真菌感染诊断中的应用比较

杜 鹏 黄嘉怡 沈守星 魏秋姣 刘小凤

浅部皮肤真菌病是由真菌侵犯表皮、毛发和甲引起的传染性皮肤病，包括头癣、手足癣、体股癣、甲真菌病和花斑糠疹等。以往临床常用检测方法为10% KOH湿片法以及真菌培养法。KOH湿片法虽然简单、快速、经济，但由于背景杂乱、检出率低，对检验人员技术水平要求较高；真菌培养法特异性高同时可以进行菌种鉴定，指导临床用药，但阳性率低、耗时长。近来，荧光染色剂calcofluor white(CFW)在真菌感染的诊断中应用越来越广。笔者对疑似浅部皮肤真菌感染的临床标本同时进行KOH湿片法、真菌培养法以及CFW荧光染色法检测，以评估CFW荧光染色法的临床应用价值。

1 材料和方法

1.1 研究对象 选取来自珠海市慢性病防治中心皮肤门诊的疑似浅部皮肤真菌感染的病人236 例，其中男104例，女132 例。皮屑标本179例，毛发标本5例，甲屑标本52例，所有标本同时采用KOH湿片法、真菌培养法以及CFW荧光染色法进行检测。

1.2 方法

1.2.1 取材 ①皮屑：先用75%的酒精消毒患者皮损部位，再用钝头刀片刮取皮屑，毛囊炎取毛囊内容物，有水(脓)疱时取疱液；②毛发：先用75%的酒精消毒患者皮损部位，再用镊子拔取毛发置于载玻片上;③指趾甲：先用75%的酒精消毒，再用尖头刀片刮取甲下甲屑。所有标本平均分为3份。

1.2.2 KOH湿片法 将适量样本置于载玻片上，滴加一滴KOH溶液，盖上盖玻片，在酒精灯火焰上方快速通过2～3次，注意不要沸腾，轻压盖玻片，用棉签吸去多余的溶液，显微镜下观察。

1.2.3 真菌培养与鉴定 将适量标本接种于含50 μg/mL氯霉素的SDA和含有500 μg/mL放线菌酮的SDA上，置26℃培养箱培养1～3周。马拉色菌接种于含菜籽油沙氏培养基，置35℃培养箱培养1～2周。观察菌落形态特征以及显微镜下观察菌丝和孢子特征，念珠菌接种于念珠菌显色培养皿进行鉴定。

1.2.4 CFW荧光染色法 将适量标本置于载玻片上，滴加一滴荧光染色液，盖上盖玻片，轻压，用棉签吸去多余的染色液。置于Olympus CX23荧光显微镜下观察，高倍镜下采集图像。

1.3 统计学方法 采用SPSS24软件进行分析，计数资料使用卡方检验，P<0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 不同感染部位样本荧光显微镜镜下形态学观察 对236例样本进行了CFW荧光染色法检查，菌丝及孢子发出明亮的蓝绿色荧光，在干净的背景下，根据典型的菌丝横隔和孢子出芽结构，易于识别(图1～6)。

2.2 三种检查方法的比较 236例患者中，皮屑标本179例，其中体股癣最多，手足癣次之。甲癣的甲屑标本52例，头癣的毛发标本5例。CFW荧光染色法检出阳性标本214例(90.6%)，KOH湿片法检出阳性标本 159 例(67.4%)，真菌培养法检出阳性标本142例(60.2%)。CFW荧光染色法检出率明显高于KOH湿片镜检法(χ2=38.67，P<0.01)，也高于真菌培养法 (χ2=59.25，P<0.01)，KOH湿片镜检法与真菌培养法无统计学差异(χ2=2.65，P=0.1)。由同一组织样本三种检查方法的阳性率对比可见，除脂溢性皮炎和毛囊炎外，甲屑中CFW荧光染色法的阳性率明显高于其他两种方法(χ2=9.18，P=0.002；χ2=74.47，P<0.001)。见表1。

图1 足癣皮屑见大量有隔细长菌丝 (荧光染色，×400)图2 股癣皮屑见有隔细长菌丝(荧光染色，×400)图3 甲真菌病甲屑见大量有隔菌丝 (荧光染色，×400)

图4 马拉色菌毛囊炎皮屑见大量未出芽孢子(荧光染色，×400)图5 头癣毛发见大量发内菌丝(荧光染色，×400)

图6 花斑糠疹见大量弧形菌丝和孢子(荧光染色，×400)

表1 CFW荧光染色法和KOH湿片法、真菌培养法的应用比较

3 讨论

浅部皮肤真菌感染的诊断主要依赖于临床标本的真菌直接镜检和培养[1]，但这两种方法存在各自弊端：真菌直接镜检时常因标本中杂质多而导致背景杂乱，尤其是甲屑标本，易把细胞壁、纤维误认为菌丝[2,3]，把气泡和油滴误认为孢子，同时易漏检散在的菌丝或孢子，镜检结果个人主观性较大；真菌培养结果与皮屑采集的质量、数量及患者的近期用药情况息息相关，而且耗时长[3]。荧光染色法通过特殊荧光素与真菌细胞壁中的几丁质产生高效、特异性结合，在荧光显微镜紫外光(波长340～380 nm)或者蓝紫光(波长420～490 nm)特定的激发光波段下，菌丝或者孢子发出明亮的蓝绿色荧光，在背景下易于分辨。同时，由于荧光染液中含有KOH成分，一方面可以溶解组织细胞，使组织透明化，另一方面，还可以去除背景中的干扰荧光，提高与背景的反差。

我们共收集236例疑似浅部皮肤真菌病患者的标本，其中CFW荧光染色法检出阳性标本214例(90.6%)、KOH湿片法共检出阳性标本 159例(67.4%)、真菌培养法共检出阳性标本142例(60.2%)。CFW荧光染色法检出率明显高于 KOH湿片法与真菌培养法。我们对标本进行了进一步的细分，按检测样本类型分为皮屑(179份)、毛发(5份)和甲屑(52份)。皮屑检查中CFW荧光染色法阳性165例(92.1%)，KOH湿片法阳性124例(69.3%)，真菌培养阳性115例(64.2%)，CFW荧光染色法与其它两种检查阳性率有显著性差异(χ2=30.18,P<0.01；χ2=40.98,P<0.01)，其它两种方法无显著性差异(χ2=1.02,P>0.05)。毛发样本主要来自头癣患者，这三种方法检查的阳性率相差无几。甲真菌病一直是实验室真菌检测的难点，由于甲屑材质厚，背景杂乱，特别容易出现假阴性，对实验室检测人员的能力提出更高的要求，本研究中CFW荧光染色法阳性率为75%，KOH湿片镜检阳性率为57.7%，我科室真菌培养阳性率为44.2%，CFW荧光染色法的阳性率明显高于其他两种方法(χ2=9.18，P=0.002；χ2=74.47，P<0.001)，无论是在检测能力还是在具体的检测过程中，CFW荧光染色最值得在甲真菌的诊断中推广。由于标本的类型以及来源的不同，三种检测方法的阳性率与其它研究无可比性，但CFW荧光染色法优于KOH湿片法、真菌培养法的结论与其它研究相同[4-7]。

CFW荧光染色法在疑难标本例如外涂膏药标本、色减型花斑糠疹皮屑、用药后复诊标本，尤其是在甲屑标本的检查中具有明显优势，也弥补了新手工作经验不足的缺点，有效降低了假阴性率。由于CFW荧光染色液可将纤维着色，从而发出荧光，但纤维在形态、大小、粗细、结构方面与菌丝具有很大差异，一般都可以分辨出。荧光染色费用的高昂限制了其在临床的大规模应用，另外，CFW荧光染色液存在荧光淬灭现象，在使用一段时间后出现荧光强度降低现象，应注意避光保存。总而言之，荧光染色法具有简单、快速、耗时短、结果直接的优点，与KOH湿片法与真菌培养法相结合，可以进一步提高真菌检查的阳性率，值得在临床推广。