Lyn抑制剂Bafetinib对恶性黑素瘤细胞株UACC62增殖和凋亡的影响

张倩倩 孟现广 黄淑红 党宁宁

恶性黑素瘤是一种来源于黑素细胞的恶性肿瘤，其中95%的黑素瘤发生在皮肤，而 5%则是发生在如黏膜、眼睛等非皮肤部位[1]。虽然皮肤黑素瘤约占皮肤恶性肿瘤的4%，但死亡率却占恶性肿瘤死亡率的80%[2]。近年来，黑素瘤的发病率和死亡率在全球范围内呈现增长趋势，我国每年就有约2万黑素瘤新发病例[3]。因此，黑素瘤的早期诊断和治疗越来越成为人们研究的热点。

Bafetinib(INNO-406)是一种有效的双重Bcr-Lyn抑制剂，可诱导慢性粒细胞白血病(CML)细胞的凋亡[4]。Lyn又称JTK8，是非受体型蛋白酪氨酸激酶SRC家族激酶(SFKs)中的一员，通过催化ATP上γ-磷酸转移到某些底物蛋白酪氨酸残基上，使得该蛋白质酪氨酸残基发生磷酸化，从而将细胞外信号转入细胞内，参与细胞的生长、发育、分化、迁移等过程。同时，Lyn也与一些疾病尤其是肿瘤的发生发展有着密切联系。既往研究表明Lyn在白血病、肾癌、头颈部鳞癌等多种肿瘤中表达量增加，并且肿瘤的发生发展与Lyn的活性密切相关，而前期实验中我们发现，Lyn在黑素瘤中高表达。因此我们希望通过研究Bafetinib是否能够抑制黑素瘤细胞UACC62中Lyn的表达，进而对其增殖和凋亡产生影响，来寻找新的治疗黑素瘤的药物。

1 材料与方法

1.1 主要材料与仪器 人恶性黑素瘤细胞株UACC62购自中国医学科学院肿瘤细胞库。培养液DMEM和胎牛血清购自美国Gibco公司，Lyn抑制剂Bafetinib购自美国MCE公司，CCK-8试剂购自北京Solarbio公司，RIPA裂解液、蛋白抽提试剂购自北京康为世纪生物科技公司。鼠抗人Lyn单克隆抗体购自美国Thermo Fisher公司，鼠抗人P-ERK、Bax、Beclin、Bcl-2单克隆抗体和鼠抗人GAPDH克隆抗体均购自美国Proteintech公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 UACC62细胞培养在完全培养液(含10%胎牛血清的DMEM)中，并置于37℃、5% CO2培养箱中孵育，根据生长速度每2～3天传代1次，取对数生长期的细胞用于本实验。

1.2.2 CCK-8法检测不同浓度的Bafetinib对人黑素瘤细胞UACC62的细胞活力及增殖速度的影响 取对数生长期的UACC62细胞，胰酶消化后调整细胞浓度，以1×103/L密度接种于96孔板，置于37℃、5% CO2培养箱中培养24 h后，弃去原有培养基，分别加入含以下浓度Bafetinib的培养液：0.05、0.1、1、10、20、50、100、500 μmol/L各100 μL，每个浓度设立3个复孔。建立对照组，对照组中只加入100 μL的完全培养液。将实验组和对照组细胞继续培养24 h后，每孔中各加入10 μL CCK-8试剂，继续孵育1 h，酶标仪测定450 nm处光密度(OD)值。同上方法铺好96孔板后，一组细胞加入合适浓度Bafetinib的培养基100 μL作为实验组，另一组只加入100 μL的完全培养液作为对照组，测0、24、48、72 h的OD值，绘制生长曲线图。

1.2.3 克隆形成实验检测Bafetinib对人黑素瘤细胞UACC62增殖能力的影响 取对数生长期的UACC62细胞，胰酶消化后成单细胞悬液。将约500个细胞接种到含有5 mL培养基的10 cm培养皿中。用10 μmol/L的Bafetinib处理细胞作为实验组，未加药的正常细胞作为对照组，在37℃、5% CO2条件下培养，直到细胞形成肉眼可见的克隆团。然后弃去培养基，用PBS溶液清洗2～3次，5 mL 4%多聚甲醛固定30 min，0.1%结晶紫染色30 min，最后用自来水冲洗后室温晾干。计数克隆细胞团，并与对照组的大小和数量进行比较。

1.2.4 Western blot检测Lyn、p-ERK、Bax、Beclin、Bcl-2蛋白的表达 收集实验组和对照组的细胞，加入细胞裂解液，提取总蛋白，并进行蛋白浓度的测定，每组各取等量的蛋白(20～30 μg)进行SDS-PAGE电泳，PVDF转膜，5%脱脂牛奶封闭，分别加入鼠抗人GAPDH单克隆抗体(1∶3000)、鼠抗人P-ERK抗体(1∶1000)、鼠抗人Beclin抗体(1∶1000)、鼠抗人Bax抗体(1∶1000)、鼠抗人Bcl-2抗体(1∶1000)、鼠抗人Lyn抗体(1∶500)，4℃孵育过夜，TBST洗膜10 min×3次。再分别加入相应的二抗(1∶3000)室温孵育1 h，TBST洗膜10 min×3次，进行ECL显影。应用ImageJ软件，通过与内参GAPDH灰度的比值，对Lyn、P-ERK、Bax、Beclin、Bcl-2蛋白进行定量分析。

1.3 统计学方法 使用GraphPad Prism 5软件分析，数据分析采用t检验，P<0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 Bafetinib对黑素瘤细胞UACC62的细胞活力的影响 CCK-8实验显示：当Bafetinib浓度<1μmol/L时，对黑素瘤细胞UACC62的细胞活力无明显影响；当Bafetinib浓度在1～50 μmol/L时，明显抑制了黑素瘤细胞UACC62的细胞活力，且呈剂量依赖性；当Bafetinib浓度>50 μmol/L时，对细胞活力的抑制作用最大，提示Bafetinib已达到黑素瘤细胞UACC62的最大致死量(P<0.05)。见图1。

2.2 Bafetinib能够抑制黑素瘤细胞UACC62的增殖 CCK-8实验显示：与正常对照组相比，当UACC62细胞经过浓度为10 μmol/L Bafetinib处理后，其OD值明显增高(P<0.05)(图2a)；克隆形成实验结果显示：与正常对照组相比较，当UACC62细胞经过浓度为10 μmol/L Bafetinib处理后，细胞的克隆形成能力受到明显抑制(P<0.05)。见图2b、2c。

2.3 Bafetinib能够有效降低UACC62细胞中Lyn的表达，并通过抑制ERK信号通路，促进细胞凋亡 Western blot结果显示：与对照组相比，当浓度为10 μmol/L Bafetinib处理后实验组细胞的Lyn、P-ERK表达水平明显降低，提示Bafetinib能够有效降低Lyn的表达，并能够抑制ERK信号通路；同时促凋亡蛋白Bax、Beclin1的表达上调，抗凋亡蛋白Bcl-2的表达下调(P<0.05)。见图3a、3b。

图1 不同浓度的Bafetinib对黑素瘤细胞UACC62细胞活力的影响* vs对照组，P<0.05；** vs对照组，P<0.01图2 CCK-8实验和克隆形成实验检测Bafetinib对黑素瘤细胞UACC62增殖能力的影响*vs对照组，P<0.05

图3 Bafetinib通过ERK信号通路诱导黑素瘤细胞UACC62的凋亡 *vs对照组，P<0.05

3 讨论

黑素瘤的发病机制相当复杂，早期诊断和治疗仍面临着很多挑战。虽然目前临床上治疗黑素瘤的药物有达卡巴嗪、伊匹单抗(ipilimumab)、达拉非尼(dabrafenib) 、维罗非尼(vemurafenib)和曲美替尼(trametinib)等，但是仍然存在一些安全性问题[5]。Bafetinib作为一种抗肿瘤新药，已有研究证实其对白血病细胞有抑制增殖及促进凋亡的作用；同时对脑肿瘤细胞也有一定的抑制作用[6]。另有研究表明Bafetinib可以抑制ABCB1和ABCG2转运蛋白介导的多药耐药性[7]。新的研究发现Bafetinib可以抑制PAR2-TrPV4偶联，减少机械性痛觉过敏，达到镇痛效果[8]；还能够抑制嗜酸粒细胞反应，在抗过敏治疗中可能起着辅助作用[9]。但Bafetinib在黑素瘤中的作用尚无研究，因此，我们希望通过研究Lyn抑制剂Bafetinib对恶性黑素瘤细胞UACC62增殖和凋亡的影响，初步了解Bafetinib在恶性黑素瘤的作用机制，从而为黑素瘤的治疗提供一个新方向。

本实验中，我们用不同浓度的Bafetinib处理黑素瘤细胞株UACC62后，通过CCK-8实验检测各组细胞的细胞活力，发现当Bafetinib浓度<1 μmol/L时，实验组的细胞活力与对照组无明显差异；当Bafetinib浓度在1～50 μmol/L时，实验组的细胞活力较对照组显著降低(P<0.05)，且细胞活力随着Bafetinib浓度的增加而降低；当Bafetinib浓度>50 μmol/L，实验组的细胞活力较对照组显著降低，但细胞活力并未随着Bafetinib浓度的增加而降低。这些提示Bafetinib抑制黑素瘤细胞UACC62的生长需要一定的浓度，并且在一定浓度范围内(1～50 μmol/L)，黑素瘤细胞株UACC62的细胞活力随着Bafetinib浓度的增加而降低，呈现明显的剂量依赖性，但并非浓度越高，抑制作用越强，当Bafetinib浓度达到50 μmol/L时，对细胞活力的抑制作用最大，即达到黑素瘤细胞UACC62的最大致死量。CCK-8和克隆形成实验表明：Bafetinib能够抑制黑素瘤细胞UACC62的增殖。为进一步研究Bafetinib对黑素瘤细胞UACC62信号通路及凋亡的影响，我们应用Western blot，结果显示：与对照组相比，用Bafetinib处理的细胞其Lyn的表达量明显降低，表明Bafetinib可以有效抑制Lyn的表达；P-ERK的表达量明显降低，即ERK的磷酸化水平被抑制，提示Bafetinib能够抑制ERK信号通路的活化；同时抗凋亡蛋白Bcl-2的表达量明显降低，而促凋亡蛋白Bax、Beclin1的表达量明显增加，提示Bafetinib能够诱导黑素瘤细胞凋亡。这些结果均表明，Lyn抑制剂Bafetinib可以影响黑素瘤细胞UACC62的增殖和凋亡，并且是通过抑制ERK信号通路的活化发挥其抑制细胞生长的作用，但具体的作用机制还需进一步的研究。

综上所述，本研究发现，Lyn抑制剂Bafetinib能够有效降低黑素瘤细胞UACC62中Lyn的表达，抑制细胞的增殖能力，并通过抑制ERK信号通路的活化，诱导其凋亡，从而为Bafetinib抗黑素瘤研究提供了依据。