原花青素对成纤维细胞紫外照射损伤的保护作用研究

徐冰心 吴莹莹 徐冰珠 秦亚亚 司少艳 崔彦

紫外线(Ultraviole,UV)是光波的一种,根据波长可分为UVA、UVB和UVC。UVC穿越臭氧层时一般会被过滤掉,不会对人体皮肤造成危害,受到关注较少。但随着环境污染导致的臭氧层越来越薄,地面紫外线强度日益增加,UVC所带来的伤害越来越受到重视。随着载人航天技术的迅猛发展,太空紫外线辐射对航天员身体健康造成的影响亦受到越来越多的关注。UVC又称短波紫外线,对人体的伤害很大,短时间照射即可灼伤皮肤,长时间或高强度还可以造成皮肤癌。紫外辐射对生物体的损伤程度,与辐射的功率和时间有关[1-2]。原花青素(procyanidine,OPC)为葡萄籽提取物或法国海岸松树皮提取物,属于特殊分子结构的生物类黄酮,因其结构中存在较多酚羟基而具有较强还原性,因而OPC一直被认为是强有效的抗氧化剂。OPC的抗自由基氧化能力分别是维生素E和维生素C的50倍和20倍。近年来国内外对其生物活性的研究较多,但对OPC体外抗紫外辐射方面的研究鲜有报道。皮肤的成纤维细胞是紫外线照射的重要靶位,本研究以小鼠皮肤成纤维细胞(NCTC clone 929,L929)为实验对象,分析OPC对受UVC辐射的小鼠成纤维细胞的作用,讨论OPC体外抗紫外线辐射的活性,为OPC在紫外防护方面的应用提供一定的理论依据。

材料与方法

一、材料与方法

(一)主要材料和仪器

小鼠成纤维细胞L929细胞系(北京协和细胞资源中心),倒置相差显微镜及照相系统(日本Olympus公司),酶联免疫光谱分析仪BIO-RAD680(美国伯乐公司),二氧化碳培养箱(日本三洋),流式细胞仪FACSCalibur(美国BD公司),紫外灯(天津合普公司),原花青素(OPC,青岛海隆达生物科技有限公司,纯度>95%)。

二、实验方法

(一)小鼠成纤维细胞L929细胞系培养扩增

小鼠成纤维细胞L929细胞系以含10% 胎牛血清及双抗(100 μg/mL青霉素和100 μg/mL链霉素)的DMEM高糖培养基,于37℃ CO2培养箱中培养。选取生长良好的4～10代对数生长期细胞进行实验。

(二)UVC照射

各组细胞生长至第4天时,弃去培养基,用温PBS冲洗两次,加入适量PBS,紫外灯预热5 min,将细胞培养板开盖,平放于紫外灯下,紫外灯处于培养板垂直上方,细胞培养板距离紫外灯垂直距离为30 cm,培养板处剂量率测得140 μW/cm2,紫外辐射剂量=辐照度×时间。

(三)MTT法检测细胞活性

分为正常对照组、照射对照组和给药组(OPC梯度为25、50、100、200 μg/mL)。UVC照射时间为357 s,总剂量为50 mJ。实验分照射前给药和照射后给药两批进行。照射前给药实验:照射前24 h,96孔板每孔接种5×103个细胞,每孔100 μL,培养24 h后加入不同浓度的OPC,30 min后采用UVC照射,培养24 h,采用MTT法检测细胞活性。照射后给药实验:6孔板每孔接种5×103个细胞,每孔100 μL,培养24 h,UVC照射,照射后立即加入不同浓度的OPC,培养24 h,采用MTT法检测细胞活性。

(四)流式细胞仪检测细胞周期和凋亡

实验分别为正常对照组,照射对照组,OPC组(25、50、100 μg/mL)。UVC照射时间为214 s,总剂量为30 mJ。每孔3 mL细胞悬液接种于6孔板,每孔接种细胞数为5×105,分5组,UVC照射,继续培养24 h,收集细胞,离心(1 500 rpm,10 min),取1×106个细胞,加300 μLPBS重悬,加700 μL预冷无水乙醇,混合均匀,置-20℃冰箱内固定48 h以上,加2 mL PBS,1 000 r/min离心5 min,弃上清,加入100 μL RNAase(100 μg/mL)室温放置10 min后,加入PI溶液300 μL(终浓度50 μg/mL),-4℃染色10 min,上流式细胞仪检测。FSC/SSC散点图对淋巴细胞设门,FL2-W/FL2-A散点图去除粘连细胞,FL2-A直方图区分G0/G1和G2/M期细胞,低速获取细胞,Modifit软件分析。

三、统计学与分析

两组间比较采用 SPSS 11.5 统计软件进行t检验、单因素方差分析，检验水准为 0.05。

结 果

一、OPC对UVC照射小鼠L929细胞活性的影响

MTT法检测细胞活性实验结果显示,未经UVC照射的正常对照组细胞均具有优良的细胞活性,UVC照射后,照射对照组细胞活性较正常对照组显著降低(P<0.05)。与照射组对照比较,照射前或照射后给予一定剂量的OPC对UVC照射成纤维细胞L929细胞细胞活性增加,照射前加入25、50、100、200 μg/mL的OPC,可以显著预防照射引起的L929细胞活性下降(P<0.05);照射后立即加入25、50、100 μg/mL的OPC,可以显著预防照射引起的L929细胞活性下降(P<0.05)。见表1。

二、OPC对UVC照射小鼠L929细胞周期和凋亡的影响

与正常对照组比较,UVC照射后24 h照射对照组细胞周期S期细胞百分率显著增多,凋亡细胞百分率显著增多,OPC各组细胞S期百分率有增多趋势,100 μg/mL显著增多(P<0.05),与照射对照组比较,OPC 25、50 μg/mL组细胞APO百分率显著降低(P<0.05)。见表1。

表1 OPC对UVC照射小鼠L929细胞活性的影响±s,n=3)

注:与正常对照组相比:aP<0.05;与照射对照组比较:bP<0.05

表2 OPC对UVC照射小鼠L929 细胞周期和凋亡的影响±s,n=3)

注:与正常对照组相比：aP<0.05;与照射对照组比较：bP<0.05

讨 论

紫外线照射是导致皮肤日晒伤、光老化及皮肤癌的重要因素。紫外辐射作用于正常细胞,首先主要引起的损伤,细胞在细胞周期的特定阶段暂时阻滞而允许损伤的细胞进行修复。损伤被修复,细胞周期进程恢复,通过细胞周期不断地循环而完成的细胞增殖得以继续,若修复失误则细胞走向凋亡,最终导致细胞死亡[3]。

从葡萄籽中提取得到的OPC是一种双黄酮衍生物,纯天然多酚化合物,兼具有强效抗氧化剂、还原剂和自由基清除剂的功效,多酚类物质是具有很强的抗氧化活性及自由基的清除抑制率,能有效保护正常细胞功能[4-6]。长期慢性紫外线照射会引起皮肤屏障功能损伤,OPC在抵抗紫外线损害、修复皮肤屏障、抑制光老化方面均具有一定的作用[7],对急性光损伤所致的角质形成细胞凋亡具有防护作用[8]。

在UVC照射前及照射后加入一定浓度的OPC,采用MTT法检测细胞活性,照射前30 min加入25、50、100、200 μg/mL的OPC,可以显著预防照射引起的L929细胞活性下降;照射后立即加入25、50、100 μg/mL的OPC,可以显著预防照射引起的L929细胞活性下降。根据本实验研究结果认为,OPC对小鼠成纤维细胞的紫外线照射保护作用在OPC浓度为25～50 μg/mL范围内作用较好,200 μg/mL辐射防护作用反而下降,可能因为OPC浓度过高影响细胞自身的正常生长。照射前给药比照射给药辐射防护作用好。实验研究结果表明照射前或照射后给予一定剂量的OPC对UVC照射成纤维细胞L929 细胞损伤具有防治作用。

UV作用于正常细胞,首先主要引起DNA的损伤,细胞在细胞周期的特定阶段暂时阻滞而损伤的细胞能够进行修复。当细胞无法修复UV所致损伤,细胞将发生凋亡以避免细胞DNA突变的产生与扩增,因而凋亡是人体细胞对外界损伤(如紫外线辐射)的一种防御性反应,日光中的UV可增加皮肤组织中的氧自由基,引起氧化损伤,同时可引起局部和系统免疫抑制和细胞凋亡,造成DNA损伤诱发突变,导致皮肤炎症、晒伤、光老化及皮肤肿瘤。OPC药理作用机制是多样的[9],抑制凋亡起到抗紫外线辐射作用是其中防护作用机制之一[10]。本实验研究发现,UVC照射后24 h,与正常对照组比较,照射对照组细胞周期S期细胞百分率显著增多,凋亡细胞百分率显著增多,笔者推测在照射后24 h,一方面无法修复UV所致损伤的细胞开始走向凋亡,另一方面,由于照射引起细胞自在细胞周期的特定阶段暂时阻滞,在发生阻滞后,损伤在照射后24 h 细胞增殖活性恢复,可能是由于细胞生长加速,照射后的细胞会代偿性的增值,从细胞周期的数据上表现在S期细胞的百分率较多。笔者在小鼠的γ电离辐射防护实验中看到过类似的实验结果[11]。与正常对照组比较,OPC各组细胞S期百分率显著增多,提示OPC可以促进L929细胞的增殖;与照射对照组比较,OPC 25、50 μg/mL细胞APO百分率显著降低,提示OPC可以减少UVC照射引起的细胞凋亡显著增多。

总之,本实验证实原花青素对UVC的辐射损伤作用具有一定的保治作用,实验结果为原花青素在抗紫外损伤方面的应用提供了一定的理论依据和数据支持。