不同途径给予胶原蛋白肽对免疫抑制小鼠免疫功能的影响

司少艳 徐冰心 吴莹莹 秦亚亚 王奎 宋淑军

胶原是细胞外基质的主要成分,参与细胞间信息的传递、细胞的增殖、分化、运动,与组织的形成、细胞免疫、肿瘤细胞的转移等密切相关。胶原蛋白肽是胶原蛋白经蛋白酶酶解后的产物。研究显示胶原蛋白和胶原蛋白肽具有多种生物学活性,如提高免疫活性、促进骨形成、抗氧化、预防心血管疾病和抑制肿瘤活性等[1-11]。绝大多数文献采用口服的方式,本课题组在之前的研究采用腹腔注射的方式给予胶原蛋白肽,发现也能改善免疫抑制小鼠的免疫功能。本研究中，笔者探究这两种给药方式对小鼠免疫功能的影响。

材料和方法

一、材料

牛骨胶原蛋白肽由中科院理化技术研究所郭燕川研究员馈赠;地塞米松磷酸钠注射液购自浙江仙琚制药股份有限公司;RPMI1640干粉购自美国Gibco公司;MTT购自美国Amresco公司;刀豆蛋白A(concanavalin A,ConA)购自美国Sigma公司;胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司;FITC标记的抗小鼠CD3抗体、PE标记的抗小鼠CD4抗体、PE-cy5标记的抗小鼠CD8抗体购自美国eBioscience公司;健康6～8周龄雄性ICR小鼠,购自北京大学医学部实验动物医学研究中心。

二、小鼠分组及给药方案

将ICR小鼠随机分为10组,每组6只,灌胃组和腹腔注射组均分为对照组、模型组以及100、300、 600 mg胶原蛋白肽/kg体重组。除对照组外,其余各组小鼠腹腔注射25 mg地塞米松/kg体重,1次/d,共3次,造模。造模的同时,胶原蛋白肽组小鼠分别腹腔注射0.2 mL等渗盐水配制的每千克体重100、300、600 mg胶原蛋白肽,1次/d,连续7 d;对照组和模型组小鼠同时腹腔注射0.2 mL等渗盐水,1次/d,连续7 d。于实验的第8天,将小鼠摘眼球取血,EDTA抗凝,然后断颈处死,无菌取脾,分别检测以下指标。

三、观察指标

(一)小鼠胸腺、脾脏大小的观察

分别称量小鼠体重和胸腺、脾脏重量,计算小鼠胸腺和脾脏指数:胸腺和脾脏的重量(mg)/体重(g)。

(二)小鼠外周血白细胞分类和计数

采用全自动血球计数仪检测小鼠外周血白细胞计数及分类。

(三)小鼠外周血CD4/CD8比值

取50 μL抗凝血,加1 mL溶血剂,冰水中裂解红细胞,PBS洗2遍后,加入100 μL含5% 小牛血清的RPMI1640,分别加入1 μL FITC标记的抗小鼠CD3抗体、PE标记的抗小鼠CD4抗体、PE-cy5标记的抗小鼠CD8抗体,室温避光孵育30 min, PBS洗2次后,加入20 g/L多聚甲醛0.3 mL,进行流式细胞仪分析,分析CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴细胞百分比,计算CD4/CD8T淋巴细胞比值。

(四)小鼠脾脏淋巴细胞增殖能力的检测

将脾脏采用载玻片磨碎,过200目细胞筛,制备脾细胞悬液;离心后加入1 mL红细胞裂解液,室温放置5～10 min,离心,PBS洗2次;用含100 mL/L新生牛血清的RPMI 1640悬浮细胞,制备1×107/mL的脾细胞悬液;96孔板每孔加100μL脾细胞悬液,加100 μL ConA稀释液,至ConA终浓度为5 μg/mL,空白孔不加ConA,加100 μL培养液,培养48 h;每孔加20 μL MTT,培养4～6 h,吸出上清,加100 μL DMSO,测定490 nm的吸光度值(A490),增殖指数=AConA/A空白。

四、统计学分析

结 果

一、不同途径给予胶原蛋白肽对小鼠胸腺和脾脏大小的影响

与模型组相比,两种途径给予胶原蛋白肽,均是从中剂量开始对胸腺指数的影响有显著意义(P<0.05),但均仍低于对照组。与模型组相比,灌胃的3个剂量对脾脏指数都没有显著影响(P>0.05),而腹腔注射3个剂量对脾脏指数均有显著影响(P<0.05),而且与对照组差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 不同途径给予胶原蛋白肽对小鼠胸腺、脾脏大小的影响±s)

注:与对照组比较：aP<0.05;与模型组比较：bP<0.05

二、不同途径给予胶原蛋白肽对小鼠外周血白细胞分类的影响

与模型组相比,腹腔注射胶原蛋白肽3个低剂量组小鼠中性粒细胞百分比及绝对值、淋巴细胞百分比及CD4+/CD8+比值差异均有统计学意义(P<0.05),而且高剂量组与对照组比较差异无统计学意义;灌胃组只有高剂量组上述指标与模型组相比有显著影响(P<0.05),而且仍与对照组有显著差异有统计学意义(P<0.05)。见图1，表2、3。

注:a为以前向角和侧向角为坐标做图,圈定淋巴细胞设R1门;b为以前向角和CD3标记荧光为坐标做图,圈定CD3+ T细胞设R2门;c为CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴细胞流式分析

图1 CD4+、CD8+ T细胞流式分析图

注:与对照组比较：aP<0.05;与模型组比较：bP<0.05

表3 灌胃给予胶原蛋白肽对小鼠外周血白细胞分类的影响±s)

注:与对照组比较：aP<0.05;与模型组比较：bP<0.05

三、不同途径给予胶原蛋白肽对小鼠脾脏淋巴细胞增殖能力的影响

与模型组相比,腹腔注射胶原蛋白肽从中剂量组开始小鼠脾脏淋巴细胞增殖能力均高于模型组(P<0.05);灌胃组只有高剂量组小鼠脾脏淋巴细胞增殖能力高于模型组(P<0.05)。见表4。

讨 论

免疫系统由免疫器官、免疫细胞和免疫分子构成,具有免疫监视、免疫防御和免疫自稳的功能,是机体抵御外来微生物入侵以及清除肿瘤细胞的第一道防线。

表4 不同途径给予胶原蛋白肽对小鼠脾脏淋巴细胞增殖能力的影响±s)

注:与对照组比较：aP<0.05;与模型组比较：bP<0.05

胶原蛋白肽是胶原蛋白的降解产物,研究显示[1,8-12]胶原蛋白肽可以提高机体的免疫功能。王凤林等[9]采用环磷酞胺诱导的免疫抑制模型,灌胃给予逞罗鳄鱼鳞胶原蛋白肽,观察到胶原蛋白肽对小鼠脾脏T淋巴细胞增殖能力有提高作用。国内学者未用免疫抑制模型,而是直接给小鼠灌胃给予胶原蛋白肽,观察到小鼠的脾脏、胸腺指数升高,迟发型过敏反应升高,反映了T细胞功能的增强[1,8,10]。Fan等[11]观察到灌胃给予水母胶原蛋白肽可以改善紫外线辐射引起的胸腺和脾脏的萎缩。本课题组前期研究显示,腹腔注射胶原蛋白肽能够提高糖皮质激素诱导的免疫抑制小鼠的免疫功能[12]。本研究中我们采用腹腔注射和灌胃两种途径给予胶原蛋白肽,观察其对小鼠的免疫功能的改善作用,以寻找最佳的给药途径。

本研究结果显示,与模型组相比,腹腔注射胶原蛋白肽从低剂量开始对小鼠脾脏指数,从中剂量开始对小鼠脾脏淋巴细胞增殖能力均具有显著改善作用,而且腹腔注射3个剂量组脾脏指数与对照组无显著差异;而灌胃给予胶原蛋白肽组均对脾脏指数无影响,且只有高剂量组对小鼠脾脏T淋巴细胞增殖能力有显著改善作用。

外周血免疫细胞包括粒细胞、淋巴细胞和单核细胞。中性粒细胞具有很强的变形能为和趋化作用,能够吞噬和消化细菌。淋巴细胞包括T淋巴细胞、B淋巴细胞和自然杀伤细胞(nature killer cell,NK)。T淋巴细胞主要参与细胞免疫,B淋巴细胞主要参与体液免疫,在防御病毒、细菌等的入侵及抗肿瘤发挥重要的功能。与模型组相比,腹腔注射胶原蛋白肽3个低剂量组小鼠中性粒细胞百分比及绝对值及淋巴细胞百分比均有显著改善作用,而且高剂量组与对照组无显著差异;而灌胃组只有高剂量组上述指标与模型组相比有显著影响,但仍与对照组差异有统计学意义。

外周血成熟T淋巴细胞主要包括CD3+CD4+T细胞和CD3+CD8+T细胞2个亚群。从功能上来看,CD4+T细胞主要是辅助性T细胞,CD8+T细胞包括杀伤性T细胞和抑制性T细胞。在正常情况下,CD4/CD8比值保持动态平衡,以维持机体内环境的稳定。当比值下降甚至倒置时,表明机体处于免疫功能低下甚至免疫抑制状态。通常情况下免疫功能低下的艾滋病患者[13]和肿瘤患者[14-15]外周血CD4/CD8比值降低,甚至倒置。本研究结果显示，模型组小鼠外周血CD4/CD8比值低于对照组,经腹腔注射和灌胃给予胶原蛋白肽后,均使CD4/CD8比值回升,并呈剂量依赖性关系。腹腔注射胶原蛋白肽从低剂量开始,而灌胃给予胶原蛋白肽只是高剂量才显著提高CD4/CD8比值,并且腹腔注射高剂量组与对照组无显著差异,使小鼠由免疫抑制状态转向正常水平。而灌胃高剂量组仍显著低于对照组,小鼠仍处于免疫抑制状态。

胶原蛋白肽是胶原蛋白的降解产物,胶原蛋白中含有多个生物活性基团,但在空间结构上其活性中心可能包埋在胶原蛋白的内部,因此通过水解得到的胶原蛋白肽,其活性中心充分暴露,更有利于发挥其生物学功能[16]。造成上述腹腔注射优于灌胃给予胶原蛋白肽的研究结果,原因可能是与灌胃相比,腹腔注射胶原蛋白肽避免了因消化道蛋白酶对胶原蛋白肽活性基团可能造成的破坏作用。具体机制有待进一步研究揭示。

综上所述，本研究结果提示，对免疫抑制小鼠免疫功能的改善作用，腹腔注射优于灌胃给予胶原蛋白肽。