茶多酚对重铬酸钾染毒小鼠肝脏损伤的影响*

彭敏，刘燕群，2，3△，唐元娟，程露，杨晔，甘维康，李杜（.江汉大学医学院，湖北武汉430056；2.江汉大学光电化学材料与器件省部共建教育部重点实验室，湖北武汉430056；3.江汉大学化环学院，湖北武汉430056）

工业上铬的用途比较广泛[1]，在某些职业环境中，铬主要是以六价的形式存在于冶金等生产工业中。有相关实验表明，在生产过程中接触过多的六价铬（Cr6+）会使人急性中毒而引起肝脏组织的损伤，严重时可诱发肺癌甚至是死亡[2]。日常生活中人们多有喝茶的习惯，茶多酚（TP）一般安全、无污染，且有强抗氧化作用，正逐渐受到人们的认可。TP的芳香环可通过结合氧自由基中的羟基来清除机体内的自由基，表现出强抗氧化能力[3]。肝脏是人体内新陈代谢的枢纽和重要的解毒器官。肝脏如果受到影响，将会影响到人体健康。有关重铬酸钾铬损害的机制研究很多，但对其损害的修复研究报道较少[4-5]，沈海涛等[6]进行了TP干预毒物研究，而利用生活中常见的茶叶提取含有多酚类化合物TP干预重铬酸钾（PD）致小鼠肝脏损伤的相关研究鲜见报道。鉴于此，本实验拟采用PD使致小鼠中毒后用TP进行干预，观察分析小鼠肝活性氧化酶指标的变化和苏木精-伊红（HE）切片情况，探讨TP对PD染毒小鼠肝脏损伤的影响，为相关研究提供实验数据和分析依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 采用无特定病原体（SPF）昆明小鼠60 只，雌雄各半，体重（23±2）g，批号：42000600023316，购于湖北省实验动物研究中心。小鼠身体状态良好，安置于室温（24±1）℃下，小鼠自由取水，每只小鼠喂食5 g饲料，适应性喂养3 d。之后称取每只小鼠的体重，根据体重差异随机分为5组，每组12只，雌雄各半，使每组小鼠的平均质量为30 g左右。

1.1.2 主要实验仪器与试剂 TP（福州日冕科技开发有限公司），纯度大于 98.0%；PD（K2Cr2O7，山东西亚化学股份有限公司），纯度99.8%。JA2003B电子天平（上海越平科学仪器有限公司），PH100-3A41L-EP生物显微镜（江西凤凰光学集团有限公司）等。

1.2 方法

1.2.1 急性毒性实验 （1）预实验：随机挑选A、B 2组小鼠进行预实验。①A组：根据相关研究，PD染毒昆明小鼠后，肾脏重量和肾脏系数均有显著升高，且浓度为21.375 mg/kg的组别升高最为明显[7]。本研究采用1/8的PD半数致死量（LD50）为标准设置浓度梯度，1/4 LD50为上限，0为下限，设置8个浓度梯度，分别为1/4 LD50、1/8 LD50、1/12 LD50、1/16 LD50、1/20 LD50、1/24 LD50、1/32 LD50、0（生理盐水）的PD溶液，分别给8只昆明小鼠灌胃。每6小时1次，每只每次灌胃0.3 mL，每天连续灌胃3次，连续灌胃3 d。不断持续观察小鼠的生活状态和活动能力，3 d后解剖观察小鼠肝脏变化情况，选出1个能使小鼠恰好表现中毒情况又不致死的适宜浓度作为正式实验PD的灌胃浓度。解剖前，小鼠生活状态不佳，精神萎靡，较安静。解剖后，因为1/4 LD50组小鼠肝脏对比0（生理盐水）组及其他组小鼠，肝脏肿大最明显，颜色暗沉且色泽不均，仔细用肉眼可观察到各叶肝脏边缘及中部均有弥漫的小结节，表现出明显病理特征。故以1/4 LD50为最适PD灌胃浓度进行正式实验。②B组：经查阅相关文献[6]，设置5个浓度梯度，分别以浓度为 200、300、400、500、600 mg/kg的 TP 溶液给 10只昆明小鼠灌胃，每个浓度组2只，灌完1/4 LD50PD溶液后隔4 h灌胃TP溶液即为一轮灌胃，每次灌胃量为0.3 mL，每天连续灌胃2轮，每天给另2只小鼠灌胃2次1/4 LD50PD溶液，作为对照组，连续灌胃3 d。解剖前，各组小鼠的活动能力和生活状态没有明显区别。解剖后，对比各组小鼠肝脏病理特征，200、400、600 mg/kg组小鼠的肝脏色泽相对鲜红，小结节较少，病理变化少。故选取200、400、600 mg/kg作为正式实验TP灌胃浓度。（2）正式实验：将60只昆明小鼠分为5组，每组12只，雌雄各半，在24℃室温下分笼，早上08：00至晚上18：00灯光照明饲养。假设每只小鼠重量为30 g，每天灌胃量为0.3 mL。根据计算结果，配制浓度为4.275 mg/mL的1瓶PD溶液和浓度为200、400、600 mg/kg的3瓶TP溶液于4℃冰箱内避光储存备用。对照组灌胃生理盐水，PD染毒组灌胃42.75 mg/kg PD溶液；在灌胃PD 6 h后，TP 组分别按 200、400、600 mg/kg浓度灌胃TP溶液（即PD+L-TP组、PD+M-TP组、PD+H-TP组）。各组灌胃时间均为2周，每天1次；每只小鼠每次灌胃体积均为0.3 mL。观察每天小鼠的生活状态，记录小鼠的体重。准备解剖之前，各组小鼠自由取水，最后1次灌胃后禁食24 h。解剖小鼠时，颈椎脱位法处死小鼠，采血、取肝脏称重并制作肝脏的HE染色切片并计算其脏器系数；离心后的血清用全自动生化分析仪检测肝组织谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、谷氨酰转肽酶（GGT）水平。

1.2.2 肝组织HE染色切片的制作 处死并解剖全部小鼠并取其肝脏，称量后，投入4%甲醛溶液中固定，保持细胞形态。乙醇脱水后，再将组织块置于二甲苯中。石蜡包埋后切片，切成的薄片固定于载玻片上，放入45℃恒温箱内烘干。二甲苯可脱去切片中的石蜡，再经过高浓度到低浓度乙醇洗脱后，用蒸馏水洗。HE染色后，制成肝的HE染色切片[8-10］。

1.3 统计学处理 应用SPSS19.0统计软件处理实验各组相关数据，计量资料采用表示，并用单因素方差分析法进行组间比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组小鼠体重及肝脏脏器系数比较 PD染毒组体重和脏器系数均低于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；PD+L-TP、PD+H-TP组与PD染毒组比较，小鼠体重有一定程度的增加，PD+L-TP、PD+m-TP组小鼠肝脏脏器系数均低于PD染毒组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 各组小鼠体重及肝脏脏器系数比较（±s）

表1 各组小鼠体重及肝脏脏器系数比较（±s）

注：与对照组同指标比较，aP＜0.05；与PD染毒组同指标比较，bP＜0.05

组别对照组PD染毒组PD+L-TP组PD+M-TP组PD+H-TP组n 12 12 12 12 12体重（g）30.78±1.18 26.87±2.61a 30.02±1.22b 28.75±1.46 30.07±3.26b肝脏脏器系数（%）4.69±0.61 5.25±0.33a 4.39±0.45b 4.34±0.25b 4.75±0.37

2.2 各组小鼠肝功能指标比较 PD染毒组小鼠血清ALT、AST、GGT水平均高于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；经不同剂量 TP 干预后，PD+L-TP、PD+m-TP、PD+H-TP组的血清 ALT、AST、GGT 水平均分别低于PD染毒组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 各组小鼠肝功能指标比较（±s）

表2 各组小鼠肝功能指标比较（±s）

注：与对照组同指标比较，aP＜0.05；与PD染毒组同指标比较，bP＜0.05

GGT（U/L）2.34±0.37 3.91±0.09a 2.90±0.68b 2.21±0.38b 2.85±0.78b组别对照组PD染毒组PD+L-TP组PD+M-TP组PD+H-TP组n 12 12 12 12 12 ALT（U/L）49.48±1.46 57.96±9.33a 42.60±3.68b 44.0±1.71b 41.43±0.63b AST（U/L）131.73±22.57 159.85±4.12a 134.15±8.21b 133.66±5.57b 134.58±13.51b

2.3 显微镜观察 将各组小鼠肝脏HE染色切片分别置于低倍镜和40倍光学显微镜下观察，结果显示，对照组（生理盐水）肝小叶之间界限较清楚，细胞在肝小叶中部的中央静脉周围呈放射状排列，肝细胞间连接紧密，可见肝血窦和门管区；小鼠肝细胞呈多边形，细胞体积较大，细胞核大而圆，核仁明显，染色质丰富（图1）。PD染毒组肝小叶界限不清楚，肝细胞水肿，有部分细胞坏死，肝细胞界限不清，有双核，核深染，有些中央静脉轮廓不清楚，大多数充血（图 2）。PD+L-TP、PD+m-TP、PD+H-TP组肝小叶界限较清楚，细胞轻度水肿，较少坏死，大多细胞界限清楚，中央静脉大多轮廓清楚，充血少（图3～5）。

图1 对照组（HE染色，40×）

图2 PD染毒组（HE染色，40×）

图4 PD+M-TP组（HE染色，40×）

图5 PD+H-TP组（HE染色，40×）

3 讨 论

本实验采用TP作用PD染毒小鼠肝脏，结果证实，在TP的干预下，TP对PD染毒肝脏所致的损伤有一定程度的保护作用。

实验动物的脏器系数可反映毒物对脏器的综合毒性损伤程度，其增大表明脏器出现了水肿、增生和充血等病理变化，若下降则说明器官表现出萎缩和退行性病变等变化[11]。动物的体重也是研究毒理学中非特异性观察指标之一。体重和脏器系数可以综合反映机体的中毒效应。本实验图2结果显示，与对照组比较，PD染毒小鼠肝脏的脏器系数增高，说明PD溶液可引起肝脏水肿、坏死等病理变化，HE染色切片也显示肝细胞水肿、出血，部分细胞坏死；PD染毒组小鼠体重下降，与李银等[12]的实验结果一致。主要是由于PD在体内蓄积引起的毒性反应，致小鼠消化不良，食欲不振，从而进食量减少，这也是小鼠体重下降的直接原因。本研究图3～5表明，经不同剂量TP干预后，小鼠肝脏脏器系数均呈不同程度降低，体重增加，表明TP干预后可减轻PD蓄积毒性对机体的影响，不断改善和修复PD对肝脏的损伤作用，并使其生理功能逐渐恢复而增加体重，HE染色切片显示肝细胞界限较为明显，出血和坏死情况较少。

分析肝脏功能最常用的方法是肝酶活性的检测，这通常也是研究肝脏损害较常规和便捷的方法之一。相关研究表明，严重损伤的肝细胞一般会出现ALT、AST和GGT水平升高，三者的变化能够帮助判断肝脏是否损伤及其损伤程度和性质[13]。本实验结果显示，PD染毒组ALT、AST、GGT 3项指标水平均升高，表明PD可增强脂质过氧化而损伤肝脏；TP干预后，ALT、AST、GGT水平均低于PD染毒组，说明TP对PD引起的肝酶升高和肝脏组织形态破坏均有不同程度的保护作用，可能与其表现出的强大抗氧化能力有关。但其具体保护机制及其所需的最佳浓度尚需要进一步深入研究探讨。