不同年龄组女性胚胎的非整倍性分析

马会平，周晓航，梁悦，刘丽英

（1. 沈阳市妇婴医院生殖中心，沈阳 110011； 2. 辽宁省计划生育科学研究院临床检验中心，沈阳 110031）

随着我国二孩政策的开放，越来越多的高龄女性渴望通过辅助生殖技术 （assisted reproductive technology，ART） 解决生育问题。女性的年龄与生育力息息相关，随着年龄的增长，女性的生育力逐渐下降，胚胎的非整倍率增加。而非整倍体是胚胎种植失败、自然流产、先天畸形的主要原因，也是导致ART失败的重要因素，更是高龄女性早期流产的主要原因［1-2］。传统ART主要采用形态学方法选择目标胚胎进行移植，而这种胚胎筛选方法并不能反应胚胎的染色体情况。 植入前遗传学筛查 （preimplantation genetic screening，PGS） 是在胚胎移植之前，对配子及早期胚胎行染色体结构和数目的检测，选择染色体为整倍体的胚胎植入母体子宫。女方年龄≥38岁，不明原因反复自然流产≥2次及不明原因反复种植失败都是PGS的适应证。理论上 PGS 应该可以阻断高龄所致的胚胎非整倍体风险，提高胚胎种植率、降低流产率［3-5］。本研究收集了沈阳市妇婴医院生殖中心患者捐赠用于科学研究的胚胎，培养至囊胚期进行胚胎活检，通过下一代测序 （next-generation sequencing，NGS） 检测胚胎的染色体整倍性情况，分析不同年龄组女性的胚胎染色体异常率，旨在探讨年龄因素对胚胎染色体整倍性的影响。

1 材料与方法

1.1 研究对象

收集沈阳市妇婴医院生殖中心患者捐赠用于科学研究的胚胎149枚，且受精方式均为卵胞浆内单精子显微注射技术 （intracytoplasmic sperm injection，ICSI） 。按年龄分为高龄组 （A组，年龄＞35周岁）和低龄组 （C组，年龄≤35周岁） 。

1.2 研究方法

1.2.1 胚胎解冻与囊胚培养：程序化冷冻的胚胎解冻采用程序化解冻液ART-8016解冻液 （美国SAGE公司） ，将装有胚胎的载杆在30 ℃的水中孵育30 s，然后将胚胎置于溶液Ⅰ中停留5 min，之后将胚胎移入溶液Ⅱ中5 min，移入溶液Ⅲ中冲洗，转移胚胎于囊胚培养液中，在37 ℃、常规三气培养箱中培养2～3 d。玻璃化冷冻的胚胎解冻方法采用玻璃化解冻液VT102 （日本加藤公司） ，解冻液提前平衡至37 ℃，将胚胎从液氮中取出后，室温停留5 s，立即移入解冻液 （thawing solution，TS） 中放置1 min，之后依次移入到稀释液 （diluent solution，DS）、洗液1 （washing solution 1，WS1） 和洗液2 （washing solution 2，WS2）中，平衡时间均为3 min，转移胚胎于囊胚培养液中，在37 ℃、常规三气培养箱中培养2～3 d。

1.2.2 囊胚活检：根据Garnder评分，对3期以上的囊胚进行滋养层细胞活检。用激光在待活检囊胚的3点钟位置上打孔，直径约30～40 μ m，将活检针插入缺口处吸取3～5个滋养外胚层细胞，将其从透明带缺口处拖出，打激光使之脱离囊胚。将活检的细胞转移至装有2.5 μ L磷酸盐平衡生理盐水的预冷离心管中，离心后置冰盒中送检。活检后的胚胎行常规玻璃化冷冻，单个存放。

1.2.3 PGS检测：全基因组扩增和文库构建采用Amplibrary kit （美国Life Technology公司） ，测序采用Ion PGM Hi-Q View OT2 Reagents （美国Life Technology公司） ，数据分析采用PGcloud平台 （北京嘉宝仁和医疗科技有限公司）。检测胚胎若缺失和或重复＞4 Mb，为非整倍体，判定为异常胚胎。

1.2.4 分析指标：

1.2.4.1 囊胚形成率 包含总囊胚形成率、高形态学评分胚胎囊胚形成率和低形态学评分胚胎囊胚形成率。

1.2.4.2 优质囊胚形成率 包含总优质囊胚形成率、高形态学评分胚胎优质囊胚形成率和低形态学评分胚胎优质囊胚形成率。

1.2.4.3 染色体异常率 包含总染色体异常率、高形态学评分胚胎染色体异常率和低形态学评分胚胎染色体异常率。

囊胚形成率=形成囊胚数/胚胎总数，优质囊胚形成率=优质囊胚个数/囊胚形成数，染色体异常率=染色体异常胚胎数/检测成功胚胎数。其中，根据Brinsden评分系统，将Day3时期级别为Ⅰ级、Ⅱ级和桑椹胚的胚胎定义为高形态学评分胚胎，Ⅲ级及以下的胚胎定义为低形态学胚胎；根据Gardner评分，3期及3期以上囊胚，不含C级的定义为优质囊胚；2期及以下囊胚为不可利用囊胚。

1.3 统计学分析

采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，组间比较采用χ2检验，P ＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组胚胎染色体异常率比较

A组解冻胚胎84枚，成功复苏82枚，形成囊胚56枚，囊胚形成率为68.3%，活检胚胎48枚 （其余8枚为2期及以下囊胚） ，均扩增成功，染色体异常数为32例，染色体异常率为66.7%；C组解冻胚胎68枚，成功复苏67枚，形成囊胚53枚，囊胚形成率为79.1%，活检胚胎50枚 （其余3枚为2期及以下囊胚） ，均扩增成功，染色体异常数为22例，染色体异常率为44.0%。2组胚胎染色体异常率有统计学差异 （P = 0.024） ，见表1。

2.2 A组Day3高、低形态学评分胚胎染色体异常率比较

A组Day3高形态学评分胚胎59枚，形成囊胚47枚，囊胚形成率为79.7%，优质囊胚32枚，优质囊胚形成率为68.1%，活检胚胎43枚，染色体异常数为27例，染色体异常率为62.8%。A组Day3低形态学评分胚胎23枚，形成囊胚9枚，囊胚形成率为39.1%，优质囊胚1枚，优质囊胚形成率为11.1%，活检胚胎5枚，染色体异常数为5例，染色体异常率为100%。A组中Day3高形态学胚胎和Day3低形态学胚胎之间胚胎染色体异常率无统计学差异 （P = 0.095） ，见表2。

表1 不同年龄组胚胎培养情况及染色体结果分析Tab.1 Results of the analysis of embryonic culture and chromosome abnormalities in embryos from different age groups

2.3 C组Day3高、低形态学评分胚胎染色体异常率比较

C组Day3高形态学评分胚胎46枚，形成囊胚42枚，囊胚形成率为91.3%，优质囊胚37枚，优质囊胚形成率为88.1%，活检胚胎40枚，染色体异常数为18例，染色体异常率为45%。C组Day3低形态学评分胚胎21枚，形成囊胚11枚，囊胚形成率为52.4%，优质囊胚4枚，优质囊胚形成率为36.4%，活检胚胎10枚，染色体异常数为4例，染色体异常率为40.0%。C组中Day3高形态学胚胎和Day3低形态学胚胎之间胚胎染色体异常率无统计学差异 （P = 0.532） ，见表2。

2.4 去除年龄因素后Day3高、低形态学评分胚胎的染色体异常率比较

表2 各组Day3时不同形态学评分的胚胎染色体结果分析Tab.2 Results of the analysis embryonic chromosomes using different morphological scores on Day 3 in each group

如果不按年龄分组，按Day3时形态学胚胎分组。Day3时高形态学胚胎105枚，形成囊胚89枚，囊胚形成率为84.8%，优质囊胚69枚，优质囊胚形成率为77.5%，活检胚胎83枚，染色体异常数为45例，染色体异常率为54.2%；Day3时低形态学胚胎44枚，形成囊胚20枚，囊胚形成率为45.5%，优质囊胚5枚，优质囊胚形成率为25%，活检胚胎15枚，染色体异常数为9例，染色体异常率为60.0%。Day3时高形态学评分胚胎和低形态学评分胚胎的染色体异常率无统计学差异 （P = 0.450） ，见表2。

3 讨论

高龄女性的生育力随着年龄的增长由盛到衰，有两方面原因，一是卵巢储备功能下降，二是卵子质量的下降导致胚胎的非整倍性几率增加［6］。本研究证实，年龄≤35岁的女性胚胎染色体异常率为44%；年龄＞35岁的女性胚胎染色体异常率为66.7%。PGS技术在辅助生殖领域广泛应用，适应证包含年龄≥38岁的女性、复发性流产和反复移植失败等，在高龄患者中应用的最为广泛，在西方发达国家高龄患者占PGS应用的50%左右［7］。RUBIO等［8］的研究证实，PGS不但可以改善临床妊娠结局，还在降低流产率和缩短确定妊娠时间上有重要意义。

随着IVF的发展，新的预测胚胎发育潜能的方法也随之出现，例如胚胎蛋白组学和胚胎代谢组学，但这些方法多数用于科研，形态学评估仍是目前被广泛应用的、便捷而又不失效率的方法。本研究结果显示，无论是按年龄分组，还是去除年龄因素，Day3 低形态学评分胚胎的染色体异常率和Day3高形态学评分胚胎的异常率无统计学差异 （P ＞0.05） 。所以根据胚胎形态学评分来评估胚胎的发育潜能，仍有一定的局限性［9］，应适时结合PGS。需要指出的是，本研究所用的胚胎大多是Day3 冷冻的胚胎，解冻后进行囊胚培养，没有将卵子形态Day1胚胎原核情况、Day 2胚胎形态考虑进去，以后的研究可以纳入。

为了提高妊娠率，目前高龄女性在移植时一般会回输2～3枚胚胎 （我中心回输2枚，大多数中心回输3枚） 。ART除了给不孕不育夫妇带来福音外，还使得这类人群的多胎妊娠率超过25%，比普通自然妊娠的多胎妊娠率高出数倍。而多胎妊娠的并发症和综合征有很多，包括子痫前期、剖宫产、静脉血栓和产后出血、早产、低出生体质量等，多胎妊娠对高龄女性来说风险更是大于低龄女性，毕竟对高龄女性来说，妊娠会面临更多的妊娠并发症和合并症［10］。ART的理想目标是一个健康足月婴儿的分娩［11］。对年轻女性 （＜ 35岁） 单胚胎移植是一种可行的选择，其临床妊娠成功率与多胚胎移植相似。而高龄女性卵巢储备功能差，获卵率低，卵子质量下降，胚胎染色体异常率高。相比之下，年龄较大的女性在单胎移植后的怀孕率显著降低［12］。高龄女性若选择单胚胎移植，那必须提供“有效”的胚胎，需要改进胚胎的选择方法。有研究［13］报道，高龄妇女选择单胚胎移植，与年轻的不孕症患者的婴儿出生率一样高。UBALDI等［14］报道，高龄女性在选择PGS之后，进行单囊胚移植，会保持低的多胎妊娠率，每一个移植胚胎的活产率显著增加。但年龄越大，妊娠结局越差。HARTON等［15］和 LEE等［16］的研究表明，虽然随着整倍体胚胎的移植，移植率和怀孕率在低龄和高龄患者之间并没有统计学差异，但在42岁以上的患者中，胚胎植入率和妊娠率下降，拥有整倍胚胎的患者移植率也下降，这一情况随着年龄的增长而恶化。